大肠杆菌重组表达系统的主要问题之一，是过量表达的目的蛋白常常以不可溶的形式存在，因而不具有生物学活性。这影响了许多蛋白的性质研究和工业应用，因此需要建立新型有效的改造方法。本文以重要工业用酶D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，DCase)为研究对象，通过共表达和基因改造技术提高其在大肠杆菌中的可溶性表达，并对突变体进行了结构与功能研究。主要研究内容如下：　　 ⑴为提高D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌中的可溶性表达，采用分子伴侣共表达技术。将三种分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE(DnaKJE)、GroEL-GroES(GroELS)和trigger factor(TF)分别与D-氨甲酰水解酶共表达。结果显示，在分子伴侣GroESL的辅助下，D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌表达系统中的可溶性明显增加，相比于野生型，酶活提高了3倍。然而在实际应用中会涉及分子伴侣诱导物可使用性问题，因此又尝试了基因定向进化的方法。　　 ⑵定向进化技术是在实验室里模拟自然进化的过程，通过对编码蛋白质的基因进行随机突变，从而定向筛选出特定突变体的有效方法。首先使用易错PCR和DNA Shuffling操作，对DCase基因进行随机突变，再通过一种蛋白质可溶性结构互补监测系统将正突变检出，筛选获得了一系列可溶性表达增加的突变体。通过详细分析这些突变体的氨基酸序列，并结合定点突变鉴定这些突变位点，揭示了与DCase的可溶性表达密切相关的三个重要氨基酸残基A18、Y30和K34。同源四聚体和单体的结构模建结果显示，A18位于β-折叠片和α-螺旋之间的一个转角上，而Y30和K34位于同一个α-螺旋，且三个突变点都位于蛋白分子的表面，远离蛋白的催化和活性中心。进一步的定点替换突变分析表明，这三个氨基酸残基的电荷改变和(或)亲水性的变化是D-氨甲酰水解酶突变体在E.coR中可溶性表达增加的两个关键因素。突变酶A18T和Y30N可溶性的增加主要由于突变位点氨基酸残基亲水性的提高；而K34E突变酶可溶性的提高可能主要归功于蛋白负电荷的增加。在此基础上，又对这三个位点进行了组合突变。SDS-PAGE结果表明，其中一个命名为DCase-M3的三联突变体(A18T/Y30N/K34E)在E.coli过量表达时，80％以上的目的蛋白成为可溶状态，很好地体现了有效突变的叠加作用。此外，对纯化的野生型DCase和突变型DCase-M3进行了酶学性质测定和对比，二者在动力学常数、热力学稳定性、最适温度、最适pH以及热稳定性等方面相似，可见在突变提高可溶性表达的同时并没有改变D-氨甲酰水解酶原有的特性。　　 ⑶在上述研究的基础上，为了弄清所获得的可溶性显著提高的D-氨甲酰水解酶突变体在工业发酵中应用的可行性，进行了D-氨甲酰水解酶改造前后发酵活力的比较实验。首先对野生型D-氨甲酰水解酶和单点突变D-氨甲酰水解酶K34E进行多种组合的摇瓶发酵实验，包括使用三种不同的培养基(LB、TB和改良的工业培养基)和三种不同的诱导温度(22℃、30℃和37℃)。结果显示，在所使用的培养条件下，单点突变D-氨甲酰水解酶K34E的酶活都不同程度地优于野生型。同时我们综合考虑D-对羟基苯甘氨酸制备的两个关键酶：D-乙内酰脲酶(DHase)和D-氨甲酰水解酶(DCase)，通过引入突变DCase(K34E)，串联构建了一菌两酶的大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pCHWT(DHase/Dcase)和E.coli BL21(DE3)/pCHMU(DHase/K34E)。发酵结果显示，突变工程菌E.coli BL21(DE3)/pCHMU表现出的DHase/DCase的综合催化效率明显高于E.coli BL21(DE3)/pCHWT，提高近一倍。此外，还对高可溶性表达的三突变酶DCase-M3进行了5升发酵罐发酵研究，结果说明，在放大发酵培养的条件下，突变酶DCase-M3与野生型DCaSe相比活力提高了近7倍，表现出很大的工业应用潜力。