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水稻是一种喜温作物,对低温非常敏感。WRKY转录因子在水稻生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等方面都发挥着重要作用。本文针对一个未被报道的WRKY转录因子基因OsWRKY63,对其在耐冷方面的功能及分子机制进行探究,为水稻耐冷品种选育提供理论基础,主要结果如下:生物信息学分析结果表明,OsWRKY63含有两个保守的WRKY结构域,属于WRKY转录因子家族成员;OsWRKY63基因启动子区域含有一些非生物胁迫相关的顺式作用元件,推测OsWRKY63可能在水稻非生物胁迫响应机制中发挥作用。为了验证这个猜想,本研究分析了OsWRKY63在低温、干旱、盐胁迫及ABA处理下的表达量变化,结果表明OsWRKY63基因受低温、干旱和盐胁迫诱导,在24 h内表达量均逐渐升高。ABA处理后,OsWRKY63基因表达量先缓慢升高,6 h达到峰值,后缓慢下降。同时OsWRKY63基因在水稻中呈现组成型表达,在茎和根中的表达量较低,穗、剑叶、倒一叶、倒二叶和叶鞘中的表达量较高。亚细胞定位表明,OsWRKY63蛋白定位在水稻原生质体的细胞核中。转录活性试验分析表明OsWRKY63具有转录抑制活性。为了验证OsWRKY63在水稻耐冷调控中的作用,本研究将其转入粳稻品种Kitaake中。通过对T3代转基因株系分子检测,确认已获得了稳定遗传的过量表达OsWRKY63的转基因株系。在芽期、苗期和孕穗期分别进行低温胁迫处理,过表达OsWRKY63的转基因株系较Kitaake均表现对冷更加敏感,这说明OsWRKY63对水稻冷胁迫起负调控作用。为了进一步研究OsWRKY63调控水稻耐冷的分子机制,首先利用qRTPCR分析了水稻中已报道的耐冷相关基因在转基因家系和Kitaake中的表达差异。结果表明多个基因在转基因家系和Kitaake中差异表达。已知WRKY转录因子可以通过结合W-box基序调控下游基因表达,且已证明OsWRKY63是一个转录抑制因子。启动子序列分析发现OsWRKY34、OsWRKY41、OsWRKY71和OsWRKY76启动子均含有W-box元件,且它们的表达量在过表达家系中均显著降低。通过水稻原生质体中的双荧光素酶报告系统和酵母单杂交验证证明OsWRKY63蛋白能直接结合在OsWRKY41和Os WRKY76启动子上,并抑制其表达,而OsWRKY63蛋白不与Os WRKY34和OsWRKY71启动子结合。其中OsWRKY76已被报道作为水稻耐冷的正调控因子。以上结果说明OsWRKY63通过直接抑制其靶标基因OsWRKY76进而调控水稻耐冷性。