目的:未成熟层黏连蛋白受体蛋白（immature laminin receptor protein,iLRP）是一种由RPSA基因编码的肿瘤抗原,已有研究证实iLRP在许多肿瘤中呈高表达;细菌鞭毛蛋白C（flagellin C,FliC）是目前唯一已知的TLR5特异性配体,也是一种常用的佐剂。在本研究中,我们选择了结直肠癌（colorectal carcinoma,CRC）为研究模型,首先检测了iLRP在CRC组织和细胞与癌旁正常组织和正常结肠上皮细胞中的表达差异;随后制备了过表达iLRP、FliC的SW480（人CRC细胞株）和CT26（BALB/c背景的小鼠CRC细胞株）肿瘤细胞,并制备成肿瘤全细胞疫苗（whole tumor cell vaccine,WTCV）,检测WTCV在体外对巨噬细胞（macrophages,Mφ）向肿瘤细胞的迁移能力和Mφ极化的影响;再通过构建小鼠CRC皮下移植瘤模型,研究WTCV对iLRP⁺的CRC带瘤小鼠的治疗效果。方法:1.在mRNA、蛋白质和组织水平检测iLRP在人和小鼠CRC组织和细胞中的表达情况（1）构建BALB/c小鼠CT26原位癌模型,使用Q-PCR、WB和免疫组化分别检测iLRP在人/小鼠CRC组织和癌旁正常组织中mRNA、蛋白、组织水平的表达差异;通过Q-PCR和Western blot分别检测iLRP在人正常结肠上皮细胞FHC和人CRC细胞株SW480中的表达差异;细胞免疫荧光实验检测iLRP在FHC、SW480和小鼠CRC细胞CT26细胞膜上的表达情况;（2）通过TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）筛选临床样本数据,统计分析iLRP基因（RPSA）在临床结肠癌患者组织样本与正常结肠组织样本中的表达差异,以及RPSA对结肠癌患者远期生存的影响。2.制备表达iLRP/FliC的肿瘤细胞（1）制备过表达iLRP和FliC的慢病毒载体并分别感染SW480和CT26,分别使用Q-PCR、Western blot、细胞免疫荧光对感染后细胞中目的基因的表达进行验证。（2）WTCV的制备:使用30%乙醇浸泡细胞30min的方法将肿瘤细胞灭活处理^[1],台盼蓝染色鉴定灭活情况,灭活后的细胞即为WTCV。3.观察WTCV在体外与Mφ共培养后对Mφ的极化以及迁移能力的影响（1）Mφ的制备:人源组,THP-1经终浓度为100ng/ml的PMA诱导24h后得到hMφ;小鼠组,NS灌洗小鼠腹腔后收集pMφ,并使用流式细胞术进行鉴定;（2）分别将WTCV与对应的Mφ共培养24h后,Q-PCR检测经共培养后的Mφ极化相关分子以及TLR5的mRNA水平表达情况;Western blot检测Mφ中IL-12和TNF-α蛋白水平的表达以及NF-κB信号通路活化情况;Transwell迁移实验检测共培养后Mφ迁移能力变化。4.CT26-WTCV用于治疗CT26荷瘤小鼠;（1）分别设计3种不同的接种方案,使用WTCV接种于BALB/c来源的6周龄雌性小鼠腋下,ELISA法检测各组小鼠血清中IgG水平,选择引起小鼠体内产生IgG含量最高的方案用于体内实验;（2）选择25只BALB/c来源的6周龄雌性小鼠构建CT26小鼠皮下移植瘤模型;小鼠皮下肿瘤生长至第5d时,使用方法4-（1）中选择的方案对小鼠进行WTCV免疫治疗,治疗期间每天观察肿瘤生长情况;距离最后一次WTCV接种第7d时脱臼处死小鼠,取出小鼠皮下肿瘤组织并做好记录;（3）取各组小鼠肝、肺、脾、肿瘤组织,免疫组化检测各组小鼠的肿瘤组织中iLRP的表达情况;流式细胞术检测各组小鼠脾脏中效应/记忆CD4⁺T细胞（CD4⁺、CD44⁺）、CD4⁺T、CD8⁺T、成熟的抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APCs）（MHCII⁺）;M1型Mφ（F4/80⁺、CD86⁺）的比例变化,HE染色观察小鼠肝、肺、肿瘤组织的形态学改变、淋巴细胞浸润情况以及肺部是否出现肿瘤转移;LDH释放试验检测经各组WTCV治疗后,小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）针对CT26的特异性杀伤效应。结果:1.iLRP在人和小鼠的CRC细胞和组织中表达量明显高于正常组织和细胞,且表达于SW480和CT26的细胞膜上我们选择将CRC作为疾病研究模型,成功构建BALB/c小鼠的CT26的CRC原位癌模型,并得到了小鼠CRC和癌旁组织的石蜡切片,同时收集了人CRC组织和癌旁组织切片（由遵义医科大学消化内科实验室提供）。免疫组化、Q-PCR和Western blot检测结果证实:iLRP在人和小鼠的CRC肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（**p<0.01）,iLRP在SW480中的mRNA和蛋白水平表达量也显著高于FHC（**p<0.01）;细胞免疫荧光结果显示iLRP表达于SW480和CT26细胞膜上。通过对TCGA数据库中下载的数据,经统计分析后发现RPSA基因在人类结肠癌临床样本中的表达量明显高于正常结肠组织临床样本,并且RPSA的表达对结肠癌患者的远期生存有影响（*p<0.05）。2.制备表达iLRP/FliC的肿瘤细胞Q-PCR检测结果显示,iLRP和FliC在感染后细胞中mRNA水平明显上调,Western blot结果显示目的蛋白分子表达于细胞膜成分处;细胞免疫荧光结果显示:FliC表达于SW480和CT26肿瘤细胞膜上,因此分别表达iLRP、FliC的SW480和CT26制备成功。3.FliC-WTCV与Mφ共培养后,通过诱导Mφ的NF-κB信号通路的活化,从而促进了Mφ向M1型极化,并促进Mφ向肿瘤细胞迁移。体外实验部分,WTCV与Mφ共培养后,Q-PCR结果显示,与Mφ组相比,FliC-WTCV所参与的共培养组不仅诱导了Mφ的TLR5的表达量增加,还促进了M1型Mφ极化相关分子IL-12、TNF-α、INOS表达;FliC-WTCV组参与的共培养组,Mφ中TNF-α蛋白水平表达量上调,而FliC、iLRP的WTCV分别或联合的共培养组,Mφ的IL-12蛋白水平表达量上调（*p<0.05）;Transwell实验结果证实,与Mφ组相比,与iLRP-WTCV、FliC-WTCV单独或联合的共培养组中的Mφ向肿瘤环境迁移能力增强（*p<0.05）;Western blot检测结果显示:FliC-WTCV参与的共培养组,Mφ的NF-κB通路活化相关分子磷酸化p65（S536）的表达呈上调（*p<0.05）。因此得出以下结论,FliC-WTCV可能通过诱导Mφ的NF-κB信号通路活化,促进Mφ向肿瘤细胞迁移,以及Mφ的M1型极化,从而形成了一个有利于机体免疫系统清除肿瘤的条件。4.iLRP-WTCV和FliC-WTCV通过诱导APCs和CTL的成熟和活化有效抑制CT26荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长体内实验部分:使用iLRP和FliC的CT26-WTCV分别或联合对CT26荷瘤小鼠进行免疫治疗,实验结果显示:iLRP-CT26、FliC-CT26、iLRP-CT26+FliC-CT26 3个治疗组均能有效抑制小鼠皮下移植瘤生长（*p<0.05）;流式细胞术检测小鼠脾脏中免疫细胞比例结果提示:iLRP-CT26参与的治疗组,小鼠脾脏中效应/记忆T细胞,CD4⁺T细胞,CD8⁺T细胞比例增加（*p<0.05）,FliC-CT26参与的治疗组中,M1型Mφ、成熟APCs比例增加;小鼠脾脏内CTL针对CT26的杀伤效应结果提示,iLRP-CT26所参与的治疗组,小鼠体内的CTL对于iLRP⁺CT26的杀伤能力增强（*p<0.05）,即iLRP-CT26可以通过改善小鼠体内效应/记忆T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的比例,以及促进小鼠体内产生针对iLRP⁺肿瘤的CTL比例,来达到抗肿瘤效果,而FliC-CT26能通过促进Mφ的M1型极化,以及APCs的成熟和活化来达到抗肿瘤效应,iLRP-CT26、FliC-CT26联合使用时可能产生协同作用,抑制CT26带瘤小鼠皮下移植瘤生长的效果（*p<0.05）。结论:1.iLRP在人和小鼠的CRC细胞和组织中的表达量高于癌旁正常组织和正常结肠上皮细胞,且iLRP表达于SW480和CT26的细胞膜表面。2.成功制备分别表达iLRP/FliC的SW480和CT26肿瘤细胞。3.FliC-WTCV与Mφ共培养后,通过诱导Mφ的NF-κB通路的活化,促进了Mφ向M1型极化以及Mφ向肿瘤细胞迁移的能力。4.iLRP-WTCV和FliC-WTCV通过诱导APCs和CTL的成熟和活化有效抑制CT26荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长。