类病毒是一类共价闭合的环状单链RNA,不编码任何蛋白质,其基因组大小在246-434 nt范围内。类病毒自身的稳定性强,不容易被脱氧核糖核酸酶降解。它是迄今发现最小的能进行自我复制的遗传因子。在自然界中,可引起十分严重的植物病害。国际病毒分类委员会将目前已经鉴定的44种类病毒分为两个科,七个属。本实验中,我们选取了具有不同属代表性的7种类病毒,它们分别是:马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid)、血苋类病毒1号(Iresine viroid 1)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid)、啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid)、桃潜花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid)、鳄梨日斑类病毒(Avocado sunblotch viroid)。本研究所选用的丝状真菌为板栗疫病病原菌,该菌是属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目的寄生内座壳(Cryphenctria.Parasitica)。本课题主要研究类病毒能否侵染栗疫病菌并在栗疫病菌中进行复制。此外,研究类病毒的侵染对宿主真菌的生长,发育和致病性的影响。本实验为研究类病毒的宿主范围,发病机制和潜在的生物控制用途提供了新的研究思路和科学依据。本实验首先构建七种类病毒的侵染性克隆,将类病毒的体外转录物通过机械摩擦侵染烟草检验其活性;并通过转化的方法侵染酵母菌株,验证类病毒是否能在酵母菌株中进行复制。通过原生质体转化的方法将类病毒体外转录物人工导入C.Parasitica原生质体细胞中,细胞再生后,在PDA培养基上筛选转化子,提取栗疫病菌ssRNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术对类病毒的侵染情况进行检测。观察稳定侵染的类病毒对寄主真菌的生长、发育及致病力的影响。主要的研究结果如下:1.构建七种类病毒侵染性克隆:本实验利用体外转录的方法,构建了ASBVd HSVd IRVd PLMVd ASSVd IRVd CSVd七种类病毒的侵染性克隆质粒,获得体外转录类病毒RNA后,摩擦接种烟草检测其活性,并验证其是否能侵染酵母菌株AH109。2.检测七种类病毒侵染丝状真菌的能力:将七种供试类病毒导入C.Parasitica原生质细胞后,利用RT-PCR技术检测发现:ASBVd、HSVd、IRVd能够在C.Parasitica中进行复制,其中类病毒ASBVd的复制相较其他两种类病毒更为稳定;ASBVd侵染的菌株经过继代培养后提取ssRNA进行RT-PCR检测,实验结果表明,ASBVd的复制量无明显减少,其他两种类病毒的复制量随继代次数的增加而逐步降低。3.分析ASBVd侵染对C.Parasitica的影响:类病毒侵染后,对栗疫病菌表型产生一定影响,菌株的生长速率及色素积累量等发生变化。4.分析ASBVd在真菌寄主中的传播情况:ASBVd侵染C.Parasitica后,与真菌病毒相似,可通过寄主菌丝融合进行传播。经RT-PCR检测证实,类病毒可从带毒菌株传播至无毒菌株;将ASBVd侵染的C.Parasitica置于光照下培养至菌株产孢后,进行单孢分离培养,提取真菌ssRNA并利用RT-PCR技术检测发现,类病毒可通过孢子进行传播。5.分析ASBVd侵染真菌寄主后的遗传变异情况:类病毒侵染栗疫病菌后,将菌株继代培养,提取第8代菌株ssRNA进行检测并测序发现,随菌株继代培养后,类病毒序列发生了突变。6.对比、分析ASBVd野生型与突变株系的侵染活力及对寄主真菌的影响:ASBVd突变株系侵染栗疫病菌后,菌株气生菌丝的量增加,生长力无明显变化,提取真菌ssRNA进行检测,结果表明,ASBVd的复制量与野生型中相比有所降低,侵染活力有所下降。