血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)在血管损伤因素刺激下可从分化型转化为去分化型并获得增殖能力,这个过程称为表型转化。VSMC表型转化是其进行增殖和迁移的先决条件,是高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础。既往研究已经证明,去分化型VSMC在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)作用下可进行分化,并重新获得收缩能力,然而ATRA诱导VSMC分化的分子机制尚不清楚。阐明VSMC表型转化的调控机制,对防治血管重塑和逆转增殖性血管病变具有重要的意义。ATRA是一种维生素A的衍生物,通过与胞内受体RAR/RXR相互作用而发挥对细胞生长、分化和凋亡的调节作用。然而,目前对ATRA抑制VSMC增殖及促进VSMC分化作用的研究尚少。krüpple样因子(krüpple-like factor,GKLF/KLF4)是KLF家族中与胚胎发育、细胞分化和癌症发生密切相关的转录因子。我室以往的研究证实, ATRA可显著诱导KLF4表达及促进体外培养的去分化型VSMC进行分化,但KLF4在ATRA诱导VSMC分化中的作用及机制尚不清楚。为了阐明KLF4在ATRA诱导VSMC分化中的作用及其分子机制,本文在系统研究ATRA对VSMC增殖、迁移、收缩等生物学行为以及分化和去分化标志基因表达的影响的基础上,进一步探讨KLF4过表达及基因沉默对VSMC表型及细胞生物学行为的影响。实验结果如下:1 ATRA对VSMC分化的影响本部分实验以VSMC分化和去分化标志基因表达作为判断VSMC表型的指标,检测ATRA对VSMC表型及增殖、迁移和收缩的影响。实验结果如下:1.1 ATRA对VSMC形态和生物学行为的影响MTT分析、细胞计数、细胞跨膜迁移和伤口愈合实验结果显示,ATRA能以浓度(5、10、20μmol/L)和时间(24、48、72 h)依赖的方式抑制VSMC增殖和迁移,以ATRA浓度为10μmol/L作用于VSMC48 h的抑制作用最强。10μmol/L ATRA作用于细胞48 h,可使VSMC形态从鹅卵石状转变为细长梭型的极性排列状态,类似于血管壁中有机组装的VSMC形态。同时,在乙酰胆碱(100μmol/L)刺激下,与对照组相比,ATRA处理的VSMC长度明显缩短,而在同样刺激条件下,常规培养的VSMC对乙酰胆碱刺激所产生的收缩反应并不明显。1.2 ATRA对VSMC分化标志基因SM22α和SMα-actin以及去分化标志基因SMemb表达的影响分化标志基因SM22α和SMα-actin(α-SMA)是VSMC处于分化状态的重要的分子标志,而去分化标志基因embryonic vascular smooth muscle myosin heavy chain-B(SMemb)则是VSMC处于去分化状态的重要标志。采用RT-PCR、Western blot和细胞免疫化学方法,分别从转录水平和翻译水平观察了各种标志基因在ATRA诱导VSMC分化过程中的表达变化。结果显示,在ATRA处理的VSMC中,分化标志基因SM22α和α-SMA表达明显升高,而去分化标志基因SMemb表达显著降低,具有明显的浓度和时间的依赖效应。其中,浓度为10μmol/L和时间为48 h时具有显著变化。2 KLF4在ATRA诱导VSMC分化中的作用对多种细胞系的研究表明,KLF4是一个重要的与细胞生长、分化和凋亡调节有关的基因。但KLF4是否参与ATRA诱导的VSMC分化以及在VSMC表型调控中发挥怎样的作用,目前尚不清楚。本部分实验观察大鼠主动脉内皮剥脱和ATRA诱导VSMC分化过程中KLF4的表达变化,以及KLF4过表达和KLF4基因敲减对VSMC分化和去分化标志基因表达及细胞表型的影响。2.1血管新生内膜中KLF4的表达变化RT-PCR和Western blot分析结果显示,血管内皮剥脱3天后,血管组织中KLF4蛋白和mRNA水平均明显升高。2.2 ATRA对KLF4表达的影响RT-PCR、Western blot结果表明,ATRA可显著诱导KLF4表达,并具有明显的时效(24、48、72 h)和量效(5、10、20μmol/L)关系, 10μmol/L ATRA作用于VSMC 48 h出现显著差异。细胞免疫化学检测结果显示,在10μmol/L ATRA刺激48 h的VSMC中,KLF4的表达明显高于对照组。2.3 KLF4过表达对VSMC分化及去分化标志基因表达的影响以KLF4腺病毒表达载体Ad-KLF4感染VSMC 48 h,经Western blot检测证实KLF4在VSMC中得到高效表达。被KLF4腺病毒感染的VSMC变成梭形,并对乙酰胆碱刺激的反应性明显高于腺病毒空载体感染的细胞。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测结果显示,在KLF4过表达的VSMC中,分化标志基因SM22α和α-SMA的表达明显高于空载体对照组,而去分化标志基因SMemb的表达则明显低于对照细胞。SM22α和α-SMA启动子区存在KLF4的结合位点,在以染色质免疫沉淀实验(ChIP)证明KLF4结合于它们的启动子后,我们进行了SM22α启动子指导的报告基因分析,结果表明,KLF4可明显增强SM22α启动子的活性。2.4 KLF4基因敲减对VSMC分化及去分化标志基因表达的影响将KLF4特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性KLF4的表达,进一步研究KLF4在ATRA诱导VSMC分化中的作用。RT-PCR和Western blot分析结果显示,KLF4-siRNA导入可敲减KLF4表达70%以上。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学分析结果显示,在ATRA刺激下,敲低KLF4表达的VSMC中分化标志基因SM22α和α-SMA的表达被明显削弱,相反,去分化标志基因SMemb的表达显著增强。而未经ATRA处理的VSMC,敲除KLF4并不能引起分化和去分化标志基因表达的明显变化。同时,敲低KLF4表达的VSMC即使经ATRA刺激也呈现一定程度的去分化状态,并对乙酰胆碱刺激诱发的收缩反应明显减弱。3 KLF4在ATRA抑制VSMC迁移中的作用VSMC增殖及其从血管中膜向内膜迁移是动脉粥样硬化斑块形成和血管成形术后再狭窄的主要原因。研究证明,VSMC的迁移与细胞外基质(ECM)的降解密切相关。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是分解ECM的蛋白酶,在血管组织中以MMP-2和MMP-9最为重要。本部分观察KLF4过表达与敲低表达对VSMC迁移活性的影响及其与MMP-2和MMP-9表达之间的关系。3.1 KLF4在VSMC迁移中发挥重要作用第一部分的实验结果证实,ATRA可显著抑制VSMC的迁移活性,为进一步弄清ATRA抑制VSMC迁移是否与KLF4表达有关,本部分实验首先用KLF4 siRNA敲减内源性KLF4表达,然后观察ATRA对VSMC迁移活性的影响。结果表明,KLF4基因敲减可使ATRA对VSMC迁移的抑制作用明显减弱;与此一致,KLF4过表达使VSMC迁移活性降低,表明KLF4在ATRA抑制VSMC迁移的过程中发挥重要作用。3.2 ATRA对MMP-2和MMP-9表达和活性的影响为了阐明ATRA抑制VSMC迁移是否与调节MMP-2和MMP-9基因表达有关,接下来我们检查了ATRA对这两种基因表达的影响。Western blot和RT-PCR结果显示,10μmol/L ATRA处理VSMC 48 h可明显降低MMP-2和MMP-9的表达。酶图分析结果显示,ATRA处理也明显降低MMP-2和MMP-9的胶原酶活性,其中以MMP-2的活性降低更为明显。提示ATRA抑制VSMC迁移与抑制MMP-2和MMP-9的表达和活性有关。3.3 KLF4对MMP-2和MMP-9表达和活性的影响Western blot和RT-PCR结果显示,与对照细胞相比,腺病毒介导的KLF4在VSMC中过表达可明显降低MMP-2和MMP-9的表达。酶图分析结果显示,KLF4过表达也明显降低MMP-2和MMP-9分解明胶的活性,其中以MMP-2的活性降低更为明显。用KLF4 siRNA敲减KLF4表达后,ATRA对MMP-2和MMP-9表达的抑制作用明显降低,酶图分析结果亦与此一致。表明KLF4抑制VSMC迁移与抑制MMP-2和MMP-9的表达和活性有关。4 KLF4在ATRA抑制VSMC增殖中的作用当血管受到损伤或体外培养的VSMC受到生长因子刺激时,VSMC可从分化表型转化为去分化表型,通过激活细胞周期进展相关激酶,启动细胞周期,使VSMC进入S期并开始增殖。周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase, CDKs)是细胞周期进展调控系统的核心,而p53是引起G1期阻滞的核心分子。本部分研究观察KLF4对VSMC增殖的影响及其与P53和CDK4表达之间的关系。4.1 KLF4对VSMC增殖活性的影响MTT和细胞计数结果显示,ATRA可显著抑制VSMC的增殖活性,但在敲减KLF4表达后,ATRA抑制VSMC增殖的作用明显减弱,而KLF4过表达可使VSMC增殖活性降低35 %左右,表明KLF4介导ATRA对VSMC增殖活性的抑制作用。4.2 KLF4介导ATRA对VSMC细胞周期的阻滞作用10μmol/L ATRA刺激VSMC 48 h可使处于S期的细胞数显著减少,同时增加了停滞于G1期的细胞数。同样,KLF4强制性表达也获得了类似的结果。相反,用KLF4 siRNA敲低内源性KLF4表达后,ATRA对VSMC细胞周期的阻滞作用明显减弱。表明ATRA对VSMC细胞周期的阻滞作用与上调KLF4有关。4.3 KLF4抑制VSMC增殖与其调节P53和CDK4表达有关Western blot和RT-PCR结果显示,ATRA能以浓度和时间依赖的方式使P53表达上调。10μmol/L ATRA刺激48 h条件下具有显著变化。同样,KLF4过表达也可使P53表达显著上调,而在敲低内源性KLF4表达后,ATRA上调P53表达的作用被明显削弱。与此相反,ATRA处理和KLF4过表达均可抑制CDK4表达,并且ATRA的抑制作用在敲低KLF4表达后明显降低。表明ATRA抑制VSMC增殖与诱导KLF4表达及由此引发的P53表达上调和CDK4表达下调有关。5 KLF4与KLF5在调节VSMC表型中的相互作用VSMC表型转化是多个基因表达变化的结果,其中,KLF4和KLF5是参与VSMC表型转化的两个重要的转录因子。它们是KLF家族中较为邻近的两个成员,具有相似的组织分布,能够识别和结合同一顺式元件,然而却往往表现出相反的生物学效应。KLF5是一个增殖促进基因,而KLF4是一个增殖抑制基因,两者通过对外界刺激信号的整合作用而维持细胞增殖与分化处于平衡状态。本部分实验用携带KLF4或KLF5的腺病毒分别或共同感染VSMC,通过过表达KLF4和/或KLF5,观察其对VSMC表型和细胞生物学行为的影响。5.1 KLF5和/或KLF4过表达对VSMC形态和生物学行为的影响Western blot结果显示,两种重组腺病毒感染VSMC 48 h后,KLF5和KLF4在细胞中均得到高效表达。KLF5过表达的VSMC进一步变圆,更加趋向于去分化状态,对乙酰胆碱刺激不能引起收缩反应,与腺病毒Ad感染的对照组相比,增殖和迁移活性明显升高。共表达KLF4和KLF5的VSMC则趋向于变成梭形,对乙酰胆碱刺激可出现轻微的收缩反应,与KLF5过表达的VSMC相比,增殖和迁移活性明显降低。而单纯KLF4过表达的VSMC显示出明显的分化型特征,细胞呈细长的梭形并集束排列,对乙酰胆碱刺激出现明显的收缩反应,细胞增殖和迁移活性明显低于Ad-KLF5和Ad-KLF4共感染组。5.2 KLF5和/或KLF4过表达对MMP-9和MMP-2活性的影响明胶酶图分析结果显示,与对照组相比,在KLF5过表达的VSMC培养基中,MMP-9和MMP-2活性明显升高;而KLF4过表达的VSMC,MMP-9和MMP-2活性明显降低。二者共同过表达时MMP-9和MMP-2活性亦有显著降低。5.3 KLF5和/或KLF4过表达对VSMC分化和去分化标志基因表达的影响Western blot和RT-PCR结果显示,VSMC被Ad-KLF5感染48 h后,VSMC分化标志基因SM22α和α-SMA表达低于对照组,KLF5与KLF4共同过表达后分化标志基因表达明显升高;而单纯过表达KLF4后,VSMC分化标志基因表达活性进一步升高。同时,检测到VSMC去分化标志基因SMemb和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达与分化标志基因的变化相反。以上结果表明,KLF5可能是VSMC增殖的促进因子,KLF4是VSMC分化的促进因子,KLF4通过拮抗KLF5的促增殖作用来发挥其诱导VSMC分化的作用。结论1 ATRA通过诱导VSMC分化标志基因SM22α和α-SMA表达、抑制去分化标志基因SMemb表达而促进VSMC从去分化型向分化型转化,表现为VSMC增殖和迁移活性降低,对乙酰胆碱刺激的收缩反应性增强。2在KLF4促进VSMC分化标志基因表达的同时也抑制去分化标志基因的表达。KLF4在ATRA诱导VSMC分化中发挥重要作用。3 ATRA对VSMC迁移活性的抑制作用与诱导KLF4表达并进而抑制MMP-2和MMP-9的表达及活性有关。4 ATRA可以有效地抑制VSMC增殖,使其停滞于G1期,此作用可能通过多种途径实现,其中,诱导KLF4表达及由此引起的P53表达上调和CDK4表达下调是其重要机制。5 KLF5对VSMC具有促增殖作用,KLF4具有拮抗KLF5的作用,并通过诱导分化标志基因表达而促进VSMC分化。