马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)致病机理研究

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类病毒是迄今为止已发现的能够侵染植物的最小病原物。它们不编码任何蛋白,完全依赖寄主植物的酶等因子进行复制并引起病症。马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是第一个被发现且研究最广的类病毒。在很多国家和地区均有发生,且不能通过药剂防治和茎尖剥离技术进行根除,严重影响着马铃薯产量和品质。PSTVd是单链环状裸露RNA,大小约359nt,可在最小自由能的情况下呈棒状二级结构,并在细胞内进行滚环式复制。前人报道其复制过程中产生的小RNA在番茄和烟草等作物病理过程中起着很重要的作用,但在马铃薯上的致病机理至今尚未报道。生物信息学预测显示PSTVd致死株系RG1致病区21nt大小的序列与马铃薯TCP转录因子编码基因StTCP23的3?UTR区进行互补。qRT-PCR和Northern Blot结果同时显示,在PSTVd侵染的马铃薯植株里StTCP23的表达量显著下调,3?RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends(RLM RACE)结果进一步验证了vd-siRNA结合StTCP23,并在预测的靶标区域出现切割。本研究利用artificial microRNA载体对PSTVd致病区域的目的sRNAs序列进行表达。转化后的马铃薯表现类似于PSTVd侵染后的生长特征,如植株矮化、茎秆分枝、块茎两端变尖、出芽率降低等。同时发现病症的严重程度与amiRNAs的积累与StTCP23的下调成正比。利用virus induced gene silencing(VIGS)方法对靶基因StTCP23进行沉默后发现,马铃薯植株表现与amiRNA转化株和PSTVd侵染株相同的生长特性,进一步证实了StTCP23在PSTVd病理中的关键作用。TCP转录因子在植物生长发育过程中起很重要的角色,尤其是与赤霉素等激素相互作用调控植物种子萌发和纵向生长。我们对StTCP基因家族进行遗传进化、激素调控等分析,发现马铃薯StTCP23与番茄SlTCP23和拟南芥AtTCP14/15同源性最高。RNA-seq和qRT-PCR结果表明StTCP23基因在马铃薯各种组织中广泛表达,尤其在茎叶和匍匐茎以及萌发的块茎里表达量最高,说明该基因在马铃薯枝叶生长和块茎发育中起重要作用。同时马铃薯TCPs对赤霉素和其抑制剂表现高度敏感。amiRNA45、46是分别表达PSTVd sRNA45、46的两个转化系。qRT-PCR结果显示这两个转化系除了StTCP323的显著下调之外还表现赤霉素含量的显著下降和赤霉素合成代谢相关基因的差异表达。提示我们amiRNA45、46表现的类似PSTVd症状或许与StTCP23和赤霉素的互作相关。体外赤霉素处理结果进一步证实了这一观点,赤霉素抑制剂paclobutrazol(PBZ)处理之后的马铃薯表现植株矮化、块茎异形,用体外GA3恢复赤霉素水平之后马铃薯株高和结薯又恢复正常。本研究探索了PSTVd致病区域诱导的siRNA靶标作用于宿主马铃薯基因StTCP23,降低StTCP23的表达量的同时影响赤霉素途径相关基因的差异表达,最终导致StTCP23和赤霉素协同调控马铃薯植株矮化和块茎发育。第一次揭示了PSTVd在宿主马铃薯上引起病症的重要机理。
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