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目的急性白血病的发生、发展机制是一个复杂的过程,许多细胞内信号转导因子和基因转录调节因子参与其中,并起着十分重要的作用。Beta-catenin是一种细胞骨架蛋白,主要介导细胞间的黏附,同时beta-catenin也作为Wnt信号通路中重要的信号传递因子参与多种基因的表达调控,其异常蓄积可使该通路的下游靶基因表达上调,促进细胞的恶性转化和肿瘤的产生。CyclinD1作为Wnt/β-catenin信号通路中的下游靶基因,介导细胞由G1期向S期的转换,其表达异常可引起细胞周期调节失控,从而导致细胞异常增殖,肿瘤发生。Wnt/beta-catenin信号通路的异常激活与结、直肠癌,肝癌,乳腺癌等多种实体瘤的发病密切相关,近有研究也揭示了其在某些恶性血液病中的作用,但在急性髓系白血病中的研究尚不深入。本研究采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测急性髓系白血病各亚型中beta-catenin及其下游靶基因cyclinD1的表达水平并分析其意义,这在国内外尚未见文献报道,本研究将为揭示急性髓系白血病的发病机制提供新的理论依据。方法一、实验材料收集中国医科大学附属盛京医院血液病治疗中心自2006年9月到2008年5月期间门诊及住院的初治急性髓系白血病患者骨髓液3-5mlEDTA抗凝,其中AML-M15例,AML-M215例,AML-M311例,AML-M413例,AML-M58例,AML-M63例,共计55例,作为实验组。收集12例良性血液病患者3-5 mlEDTA抗凝骨髓标本作为对照组。二、实验方法抗凝骨髓液经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离单个核细胞（MNC）;提取总RNA;配置逆转录反应体系10μl合成cDNA;引物由Takara公司设计合成,采用SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法检测beta-catenin和cyclinD1mRNA表达水平,具体步骤按说明书,以GAPDH作为内参照。三、结果判断将标准品cDNA8倍浓度梯度稀释为5-6个浓度梯度,各取2μl作为模板进行Real TimePCR反应,由各扩增曲线得到的CT值制作标准曲线,从而得到样本的拷贝数。以GAPDH作为内参照,beta-catenin和cyclinD1作为目的基因,通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。四、统计学分析方法应用SPSS13.0版统计软件进行数据分析,以目的基因的相对表达量为参考值,各组间的比较采用非参数统计中Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis检验,p＜0.05为有统计学意义,相关性分析采用Bivariate线性相关分析。结果1、方法的可靠性和准确性（1）RNA的纯度和质量分析所提取的总RNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,条带清晰可见,无明显降解。（2）扩增的特异性及定量的准确性标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应,制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数（r2）均＞0.998,斜率在-3.3至-3.5之间,反映定量准确,扩增效率良好。扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋,无其他非特异性锋,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。2、Beta-catenin基因在急性髓系白血病各亚型中的表达Beta-catenin在55例急性髓系白血病各亚型患者MNC中的表达较对照组12例良性血液病患者的表达量明显增高（p=0.004）,其中AML-M4、M5呈高表达(中位数分别为1.72×102和1.735×10-2),AML-M3呈低表达(中位数为0.303×10-2),AML-M3与急性髓系白血病其他亚型间无统计学差异（p＞0.05）。3、CyclinD1基因在急性髓系白血病各亚型中的表达CyclinD1基因在急性髓系白血病各亚型中均呈现不同程度的过度表达,表达量明显高于良性血液病对照组,其中AML-M2呈高表达(中位数为4.82×10-4),AML-M3呈低表达,AML-M3与AML-M6表达量间存在统计学差异（p=0.038）,其他各亚型间cyclinD1 mRNA表达水平无统计学差异（p＞0.05）。对照组12例良性血液病患者MNC中均检测到较低水平的cyclinD1 mRNA的表达。4、急性髓系白血病各亚型中beta-catenin基因和cyclinD1基因表达的相关性分析对55例急性髓系白血病各亚型患者（AML-M15例,AML-M215例,M311例,M413例,M58例,M63例）的beta-catenin及cyclinD1表达量进行相关性分析,结果表明,在AML-M1,AML-M2,及AML-M4中beta-catenin和CyclinD1的表达水平呈显著正相关（r=0.887,p=0.045;r=0.627,p=0.022;r=0.756,p=0.011）。但AML-M3、M5、M6中beta-catenin及CyclinD1的表达水平无明显相关性。结论AML患者存在beta-catenin及cyclinD1的过度表达,且在部分亚型中存在显著相关性,认为Wnt/beta-catenin通路在AML中被异常激活,且很可能通过激活该通路下游靶基因cyclinD1,参与白血病细胞的周期紊乱和异常增殖的调节。