微生物燃料电池强化氧四环素降解研究

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氧四环素(oxytetracycline,OTC)作为一种重要的广谱性抗生素,对革兰阳性菌和阴性菌均有抑制作用,也常被作为生长促进剂广泛应用于畜牧养殖业。但由于其过度使用,且传统废水处理方法难以对其进行有效处理,因此OTC已广泛进入地表水、地下水、饮用水和底泥沉积物等环境媒介。OTC不仅会长期存在于环境中对生态系统产生直接的破坏,也会加速微生物产生抗药性和抗性基因等污染问题。微生物燃料电池(microbial fuel cells,MFC)是一种耦合微生物和电化学氧化还原的、环境友好的污染物高效处理技术,在处理染料、重金属、高氯酸盐等众多难处理污染物方面均取得显著效果。但目前没有文献报道MFC对OTC这一重要抗生素污染物的去除,因此本论文研究了利用MFC对OTC的去除作用,探讨利用MFC去除含OTC废水的可行性,并对长期去除OTC的体系中的微生物群落结构和抗生素抗性基因变化进行了系统研究,以促进MFC及微生物电化学技术在含OTC废水处理中的应用。  通过一定时间的驯化,MFC能够实现对OTC的快速降解。利用OTC为唯一碳、氮源驯化1个月后,MFC在6d内对0.60mg·L-1OTC的去除率为83.33%,MFC和开路组在去除效率上基本一致。但在经过10个月驯化后,在78h内,MFC对于10mg·L-1OTC的去除率达到了99.00%以上,而开路组的去除率为58.26%左右,说明经过长期驯化后,MFC相比于传统厌氧法,能够对OTC降解起到强化效果。同时利用模式菌株Escherichia coli DH5α和Shewanella oneidensis MR-1对反应器出水毒性验证发现,OTC经MFC处理后基本失去抗菌活性。而通过监测MFC电压输出变化发现,MFC的产电能力从110mV恢复至620mV,侧面反映MFC中微生物能够以OTC为唯一碳、氮源进行生长代谢,从而实现OTC的快速去除。最后,利用激光共聚焦显微镜和标准化ATP试剂盒分别对固定于生物膜的微生物和悬浮微生物的活性进行测定发现,固定于MFC生物膜上的微生物活性菌的数目远大于死菌,说明生物膜具有良好活性,同时发现相比于开路组,MFC反应器中悬浮微生物体内含有更多的ATP,揭示了其具有更高的新陈代谢活性,从而实现更高效的OTC降解。  利用高通量测序方法研究接种猪粪、乙酸钠阶段和OTC驯化阶段的MFC和开路组生物膜上微生物群落多样性和物种组成变化发现,底物和运行模式对微生物丰富度与多样性具有显著的影响,在长期以OTC为唯一底物运行下,MFC的Shannon指数最低,说明微生物群落向着特定化、专一化的功能菌群发生演化。并且相比于接种猪粪,在10个月OTC驯化后的MFC微生物群落组成也发生了显著变化。在门水平上,Firmicutes出现了极大富集,而Spirochaetae和Bacteroidetes大量减少。在纲水平上,主要由Clostridia、α-、β-和γ-Proteobacteria组成。经分析,α-、β-和γ-Proteobacteria在生物阴极强化氯霉素的降解体系和缺氧/好氧膜生物反应器处理OTC、四环素和磺胺甲恶唑等多种抗生素体系中均属于优势菌群,说明它们在降解OTC体系中具有不可或缺的作用。在属水平组成上,Eubacterium spp.的丰度显著提高至91.69%±0.27%,经分析,Eubacterium spp.对多种氧杂环芳香族化合物具有一定的生物降解能力,而OTC是一种具有十二氢化并四苯基本结构的抗生素,故结合本研究结果,Eubacterium spp.是一类具有降解OTC能力的功能菌属。  利用高通量定量PCR技术对长期处于OTC胁迫下生物膜上抗性基因的变化情况进行研究,同时评估了不同浓度OTC胁迫下反应器出水中抗性基因相比于原始接种猪粪的富集情况。经检测,原始猪粪中共检测出32种抗性基因,种类最为丰富,而在OTC长期驯化的MFC中共检测出10种抗性基因,为所有样品中最少。基于Bray-Curtis距离矩阵算法对抗性基因进行PCoA分析发现,底物和运行模式对抗生素抗性机制具有一定影响,并且运行模式对抗生素抗性机制的影响大于底物。另外,MFC总的抗性基因归一化丰度相比于开路组也较低,说明相比于传统厌氧法,MFC生物膜产生抗性基因的可能性更低,同时,可移动元件抗性基因的归一化丰度为0.0065copy·cell-1,为所有样本中最低丰度,说明MFC生物膜上产生的抗性基因水平转移的可能性更小。最后,对反应器出水抗性基因的富集情况表明,抗生素浓度与出水中的抗性基因丰度并不存在一定直接的联系。但Tp614作为一种转座酶基因被显著富集,说明反应器的出水可能产生抗性基因水平转移,需要与其他技术连用去除出水菌体中所携带的抗性基因。  基于以上MFC长期处理OTC体系,利用平板划线法从MFC体系中分离出一株甲基杆菌属纯菌Methylobacterium sp.YWF1,能够对单一和混合四环素类抗生素污染实现降解去除。经降解能力测试发现,Methylobacterium sp.YWF1在36h内对10mg·L-1金霉素、氧四环素和四环素的去除效率分别为99.00%、62.44%和7.37%。在10mg·L-1金霉素、氧四环素和四环素同时存在的混合类污染体系中,Methylobacterium sp.YWF1在36h内对3种以上抗生素的去除率分别为83.18%、27.71%和24.40%。  本研究证明了MFC对含OTC废水快速去除的可行性,通过功能菌群的分析为工业化含OTC废水的快速启动提供了科学依据,并通过对抗性基因变化情况进行了评估,有助于后期提高MFC处理抗生素废水的生物安全性,最后分离纯菌可用于工业化制备菌剂添加于四环素类抗生素污染,起到生物修复的作用。
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