研究背景帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种中老年群体常见且高发的神经退行性疾病,其主要病理改变是中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元的进行性丢失,由此诱发一系列严重影响患者生活质量的运动及非运动障碍症状。基于PD的病因病机学研究,学者提出PD的发生发展与线粒体动态平衡密切相关。线粒体分裂蛋白和线粒体融合蛋白可以调控线粒体动态平衡,进而影响线粒体的形态结构及功能。作为调控线粒体内膜融合的关键分子,视神经萎缩蛋白1（opticatrophy 1,OPA1）与PD的发生发展密切相关,但具体作用机制尚未完全清楚,需进行更深入的研究。目前临床上主要采用左旋多巴等药物对PD进行对症治疗,此类药物虽能改善PD症状,但有副反应多和疗效减退等弊端。中医药防治PD因具有毒副作用小、疗效稳定的优点,在临床广泛应用。其中,由古方大补阴丸和牵正散组合而成的补阴牵正方（Bu-Yin-Qian-Zheng-Fang,BYQZF）具有滋补肝肾、祛风化痰、通络止痉等功效,是临床治疗PD的常用方剂。已有的初步研究表明,BYQZF不仅能够改善PD细胞模型中线粒体的形态结构和功能,而且能够调控OPA1的表达。但是,BYQZF的这种改善作用与OPA1的关系及BYQZF调控OPA1表达的作用机制尚不清楚。本研究从维持线粒体动态平衡的关键分子OPA1的亚基L-OPA1入手,构建L-OPA1过表达及敲减的PD细胞模型,揭示L-OPA1改善PD细胞模型线粒体形态结构和功能的作用机制;阐释BYQZF通过L-OPA1维持线粒体质量的分子机制;进一步说明BYQZF对PD模型GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的影响,阐明BYQZF防治PD的作用靶标和环节。为临床应用BYQZF治疗PD提供实验依据,并为深入阐释线粒体与中医“阴阳”及“肝肾阴虚”证候的相关性提供科学内涵。研究目的1.以维持线粒体动态平衡的相关分子为切入点,从PD细胞水平揭示BYQZF对线粒体形态结构和功能的影响及机制,阐明该方通过GSK3β/OMA1/L-OPA1通路保护PD细胞线粒体的作用环节。2.以维持线粒体动态平衡的关键分子L-OPA1为切入点,揭示融合蛋白L-OPA1对PD细胞模型线粒体形态和功能的改善作用,阐明BYQZF对PD细胞线粒体形态和功能的改善作用与L-OPA1的相关性。3.探讨BYQZF对PD动物模型脑GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的调控作用,进一步揭示BYQZF调节L-OPA1维持线粒体动态平衡的途径。研究方法第一章BYQZF对PD细胞模型线粒体形态结构和功能的影响:选用SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型,中药BYQZF干预,CCK-8法检测各组细胞存活率;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;透射电镜观察各组SH-SY5Y细胞超微结构变化;采用线粒体探针,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞线粒体的形态;应用荧光素酶法检测线粒体ATP水平及ADP/ATP比率;JC-1法检测线粒体膜电位;流式细胞仪检测线粒体ROS水平;Western Blot技术检测细胞CytC蛋白的表达。第二章BYQZF对PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响及作用机制:在第一章的基础上,采用Western Blot技术检测线粒体分裂蛋白DRP1、FIS1、MFF,线粒体融合蛋白MFN1、MFN2、L-OPA1及OMA1和GSK3β蛋白的表达;采用免疫荧光双标技术观察分裂蛋白DRP1和TOM20、DRP1和FIS1、DRP1和MFF、融合蛋白MFN1和TOM20、MFN2和TOM20、OPA1和COXIV的表达和共定位水平。第三章BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:构建L-OPA1过表达/敲减质粒并用脂质体介导法转染SH-SY5Y细胞,Western Blot技术及qPCR技术鉴定L-OPA1过表达/敲减水平。在此基础上进行MPP+造模及BYQZF的干预,检测细胞存活率和凋亡率、线粒体形态、ATP水平、ADP/ATP 比率、线粒体膜电位、ROS水平及Cyt C蛋白的表达水平,方法同第一章。第四章BYQZF对L-OPA1调控PD细胞模型线粒体分裂融合蛋白的影响:基于第三组的分组和干预,进一步检测DRP1、FIS1、MFF及MFN1、MFN2、L-OPA1蛋白的表达水平,方法同第二章;观察DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF、MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COXIV的表达和共定位水平,方法同第二章。第五章BYQZF对PD动物模型脑GSK3β/OMA1/L-OPA1通路的影响:选用MPTP构建PD小鼠模型,中药BYQZF的干预,免疫荧光技术观察中脑黑质TH 阳性神经元的表达;透射电镜观察各组小鼠中脑黑质DA神经元的超微结构;JC-1法检测PD动物脑线粒体膜电位水平;Western Blot技术检测各组小鼠脑内DRP1、FIS1、MFF及MFN1、MFN2、L-OPA1、OMA1和GSK3β蛋白的表达水平;免疫荧光双标技术检测各组小鼠中脑黑质 DRP1 与 TOM20、DRP1 与 FIS1、DRP1 与 MFF、MFN1 与 TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的表达和共定位水平。研究结果1.第一章结果:BYQZF可显著改善PD细胞模型线粒体形态结构和功能的损伤。可抑制细胞凋亡,增加细胞存活率,增加线粒体活性、长宽比及网络分支数、ATP水平及线粒体膜电位,降低ADP/ATP 比率、ROS及CytC的水平。2.第二章结果:BYQZF可显著提高PD细胞模型MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达;降低DRP1、FIS1和MFF及GSK3β、OMA1蛋白的表达;增加MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的共定位水平;降低DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF的共定位水平。3.第三章结果:相较于L-OPA1过表达模型组,L-OPA1过表达中药组的线粒体活性、线粒体形态因子、长宽比及网络分支数增多、ATP水平和线粒体膜电位升高,ADP/ATP比率、ROS及CytC的水平下降;细胞存活率升高,凋亡率下降。相较于空载中药组,L-OPA1过表达中药组的细胞存活率升高,凋亡率下降。相较于L-OPA1敲减模型组,L-OPA1敲减中药组的线粒体形态因子、线粒体膜电位升高,ADP/ATP 比率及CytC的水平下降,细胞存活率升高。相较于空载中药组,L-OPA1敲减中药组的细胞存活率、线粒体活性、线粒体形态因子、长宽比及网络分支数增多、ATP水平和线粒体膜电位显著降低,ADP/ATP比率、ROS及CytC的水平及凋亡率显著升高。4.第四章结果:相较于空载中药组及L-OPA1过表达模型组,L-OPA1过表达中药组的MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达显著升高,DRP1、FIS1和MFF蛋白的表达显著下降;且融合蛋白与线粒体的共定位增多,分裂蛋白与线粒体的共定位减少。相较于空载模型组,L-OPA1敲减中药组的DRP1、FIS1蛋白的表达及与线粒体上的共定位显著下降,但融合蛋白无显著改变;相较于空载中药组,L-OPA1敲减中药组的MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达显著降低,DRP1、FIS1和MFF蛋白的表达显著升高;且融合蛋白与线粒体的共定位减少,分裂蛋白与线粒体的共定位增加。5.第五章结果:BYQZF可显著改善PD小鼠黑质TH阳性神经元数量的减少、超微结构的损伤;提高脑线粒体膜电位水平;增加PD小鼠脑MFN1、MFN2及L-OPA1蛋白的表达;降低DRP1、FIS1和MFF及GSK3β、OMA1蛋白的表达;增加PD小鼠黑质MFN1与TOM20、MFN2与TOM20、OPA1与COX IV的共定位水平;降低DRP1与TOM20、DRP1与FIS1、DRP1与MFF的共定位水平。结论1.BYQZF对PD模型线粒体动态平衡的调控与L-OPA1密切相关,可通过增加线粒体融合蛋白的表达及与线粒体的共定位水平,减少线粒体分裂蛋白的表达及与线粒体的共定位水平,改善线粒体形态结构和功能的损伤,发挥保护DA神经元的作用。阐释了具有滋补肝肾（治本）、祛风化痰、通络止痉（治标）功效的BYQZF防治PD的分子生物学机制可能与L-OPA1调控线粒体分裂融合的“阴阳”平衡,减轻肝肾亏虚引发的线粒体损伤有关。2.BYQZF维持线粒体动态平衡保护DA神经元的作用环节,可能与通过抑制GSK3β和OMA1的表达,进而减少L-OPA1的水解,改善PD细胞和动物模型线粒体形态结构和功能的损伤有关。