5-氟-2-脱氧尿苷(FUdR)是一种氟代脱氧核苷类似物,被广泛用于治疗各种肿瘤。但FUdR在临床上表现出较低的口服生物利用度和各种毒副作用。现已证明其单酯衍生物较之亲代化合物具有更高的抗肿瘤活性。此外,酰化反应也是核苷化学中一类重要的基团保护反应。3-或5-羟基保护的核苷是合成各种具有药用价值的寡聚核苷酸的重要砌块。化学法酰化存在区域选择性差、需要保护/脱保护步骤和环境不友好等诸多问题。无疑,反应条件温和、高效、高选择性和绿色的酶法酰化是一条极具前景的替代途径。基于上述情况,本论文首先以FUdR己酰化为模型反应,探讨了在低毒性有机溶剂中脂肪酶催化FUdR高区域选择性酰化的可能性,并研究了各因素对酶促酰化反应的影响规律；随后研究了离子液的添加对酶促FUdR及其类似物苯甲酰化反应的影响:最后,系统地研究了来源于Pseudomonas cepacia(PSL-C),Candida antarctica B(CAL-B)和Thermomyces lanuginosus(TLL)的固定化脂肪酶在核苷酰化反应中的底物识别。 在有机溶剂中酶促FUdR己酰化研究表明,酶源、有机介质和初始水活度是影响酶促反应的三个关键因素。CAL-B和PSL-C均能高效和高选择性地催化FUdR己酰化。但两者的区域选择性相反,CAL-B优先催化5-羟基酰化,而PSL-C优先催化3-羟基酰化。对于PSL-C催化FUdR己酰化,未经水活度控制的脱水丙酮是最适反应介质。其最优酶量、底物摩尔比(己酸乙烯酯/FUdR)和反应温度分别为20 U/mL、7.5和35-40℃。在最适反应条件下,底物转化率和3-区域选择性分别为>99％和94％。稳定性实验研究表明,PSL-C在丙酮和THF中均具有较高的操作稳定性。 在含离子液介质中PSL-C促FUdR苯甲酰化研究表明,不仅离子液的阴离子和阳离子类型对酶促反应有影响,而且阴阳离子间的匹配对酶促反应的顺利进行也很重要。经优化,我们发现向THF和丙酮中分别添加5％(v/v)的[C4MIm]PF6和[C6MIm]BF4均能有效地提高酶促反应速度和3-区域选择性。在THF-[C4MIm]PF6(5％,v/v)中,FUdR及其类似物能通过酶法以高转化率(97-99％)和中等至高区域选择性(81-98％)转化成目标产物3-酯衍生物。酶促反应的3-区域选择性随2-脱氧核苷中5-取代基疏水性的增强而增大,其原因可能是在3-酰化过渡态中,5-取代基与酶活性中心的氨基酸残基Leu287疏水性侧链间存在远程相互作用。 以TUdR为酰基受体,研究了PSL-C、CAL-B和TLL催化其与不同结构的酰基供体(包括九种直链脂肪酸乙烯酯(C2-C18)和其它七种带取代基或官能团的羧酸乙烯酯)的酰化反应。结果表明,此三种酶均具有较广的底物谱。PSL-C在各种直链酰基供体中对乙酸乙烯酯(C2)表现出最高的活性,且酶促反应速度随链长的增加而降低,而3-区域选择性则随链长的增加而增大。其原因可能是大的酰基供体导致5-酰化过渡态构象失稳。CAL-B和TLL分别为对丁酸乙烯酯(C4)和辛酸乙烯酯(C8)表现出最高的活性,这是由酶的结构,尤其是活性中心结构所决定的。当酰基供体含有α-取代基或不饱和键(如双键或苯环)并与羰基共轭时,由于位阻效应或共振效应的作用,会极大地降低酶促其与FUdR酰化反应速度。有趣的是,TLL催化后者与FUdR进行酰化反应时,区域选择性会发生逆转,这可能与酶活性中心的“盖子”中的氨基酸残基Trp89有关。 以月桂酸乙烯酯为酰基供体,研究了PSL-C、CAL-B和TLL催化其与12种不同结构的核苷类化合物(包括五种2-脱氧核苷类似物：2-脱氧尿苷1a、FUdR 1b、β-胸苷1c、5-溴-2-脱氧尿苷1d和碘苷1e;五种核糖核苷类似物：尿苷1f、5-氟尿苷1g、5-甲基尿苷1h、5-溴尿苷1i和5-碘尿苷1j;2-氟-2-脱氧尿苷1k和阿糖尿苷1m)的酰化反应。结果表明,PSL-C在催化2-脱氧核苷类似物1a-1e月桂酰化反应中表现出优异的3-区域选择性(96-99％),而在核糖核苷类似物1f-1j酰化反应中仅表现出低至好的3-区域选择性(59-89％)。结合前人的分子模拟研究,这可能与PSL-C活性中心的氨基酸残基Tyr29有关。1k和1m的酰化结果也进一步支持了上述推测。相反,CAL-B和TLL在催化2-脱氧核苷类似物1a-1e月桂酰化中仅表现出低至中等的5-区域选择性(49-83％),而在核糖核苷类似物1f-1j酰化反应中表现出优异的5-区域选择性(94->99％)。尽管CAL-B和TLL在核苷类化合物月桂酰化中表现出类似的催化特性,但其分子基础却不同。CAL-B之所以在核糖核苷类似物1f-1j月桂酰化中表现出高的5-区域选择性是因为2-羟基的存在,导致空间位阻的出现,使3-酰化过渡态失稳。而TLL在催化1f-1j酰化中表现出高选择性是因为2-羟基与酶分子醇基键合位点的氨基酸残基Tyr21形成分子间氢键而稳定5-酰化过渡态。 本研究不仅丰富了酶学基础理论知识,而且开辟了一条可用于核苷类化合物高效、高区域选择性酰化的新途径。同时,合成了一系列结构新颖的核苷类化合物的酯类衍生物(99种),建立一个可供生物活性物质筛选的化合物库。