亚洲带绦虫六钩蚴Ta18抗原重组枯草芽孢生物学活性及免疫保护效果研究

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目的:研究已构建成功的亚洲带绦虫六钩蚴Ta18抗原重组枯草芽孢的生物学活性。初步探索家猪口服Ta18抗原重组枯草芽孢的免疫保护效果。为研究新型高效抗绦、囊虫病疫苗提供实验基础。  方法:Ta18抗原重组枯草芽孢生物学活性研究:使用DSM(Difco Sporulation Medium)培养基,采用“耗竭法”诱导芽孢生成,收集芽孢;提取芽孢外壳蛋白,使用 Ta18抗血清,通过蛋白印迹(Western Blotting)、免疫荧光、流式细胞仪验证外源蛋白在重组芽孢表面的表达;模拟胃、肠道环境,进行枯草芽孢耐胃、肠道环境的抗性评估。对亚洲带绦虫进行形态和分子鉴定。对Ta18抗原重组枯草芽孢免疫保护效果进行评估:分离亚洲带绦虫虫卵,体外孵化六钩蚴,分3组进行体外杀伤六钩蚴实验,进行统计学分析;设三组即重组枯草芽孢组(用Pus186-CotC-Ta18免疫)、空载体枯草芽孢组(用Pus186-CotC免疫)和常规感染组(用生理盐水处理),口服免疫家猪,定期收集血清和粪便,ELISA法检测血清中IgG及粪便中IgA的含量变化;免疫家猪后,用亚洲带绦虫虫卵攻击感染家猪,于感染后第30、40天,分批处死家猪,仔细检查家猪体内囊尾蚴寄生情况,计数虫荷;取感染家猪肝脏组织做病理切片,伊红-苏木素(HE)染色,观察肝脏病变情况。  结果:Ta18抗原重组枯草芽孢生物学活性研究:DSM培养基培养36h诱导芽孢生成;提取芽孢外壳蛋白行15%SDS-PAGE,结果表明目的蛋白在芽孢表面高效表达,芽孢外壳蛋白能被重组蛋白Ta18免疫的SD大鼠血清识别;使用重组蛋白特异性抗血清,免疫荧光能检测到芽孢表面 Ta18的表达;流式细胞仪能检测到重组芽孢有特异强荧光光峰;枯草芽孢在模拟胃、肠道环境中活力不受影响。亚洲带绦虫鉴定:经鉴定采集的虫种均为亚洲带绦虫。Ta18抗原重组枯草芽孢免疫保护效果研究:抗Tal8多抗血清对六钩蚴具有明显的杀伤作用;家猪粪便Ta18特异性IgA水平显著高于非重组芽孢免疫组(p<0.05)。血清Ta18特异性IgG水平与非重组芽孢免疫组相比差异性不显著(p>0.05);免疫的家猪用虫卵攻击感染后,分别在第30,40天处死家猪,只在肝脏发现有囊尾蚴的寄生,而其他脏器和肌肉中都未检出囊尾蚴;统计囊尾蚴在家猪肝脏中的寄生数量,囊虫数显著减低,减虫率达75.4%;感染家猪肝脏病理切片显示部分肝细胞水肿,组织内较多嗜酸性粒细胞聚集,并出现嗜酸性变,囊尾蚴周围有大量炎性细胞包绕。  结论:Ta18在重组枯草芽孢表面具有较好的稳定性,可大量诱导表达,重组芽孢能耐受模拟胃、肠道环境,可通过口服免疫产生针对亚洲带绦虫的保护性免疫。通过对Ta18重组枯草芽孢免疫效果的初步探索,为研制新型高效抗绦、囊虫病疫苗奠定了基础。
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