第一部分 牙髓干细胞膜片的培养及成骨能力检测目的 研究使用适宜浓度的维生素C培养出牙髓干细胞膜片,在细胞膜片层面上进行成骨能力等生物特性检测。为牙周组织工程中的临床应用提供理论基础。方法 拔除年轻志愿者的健康阻生齿,收集牙髓,在体外使用改良组织块法培养牙髓干细胞。原代培养后,当细胞汇合达80%进行传代培养。对牙髓干细胞进行形态学观察以及流式细胞技术鉴定。P2-P4代牙髓干细胞用于本实验研究。将不同浓度梯度的维生素C(0,10,20,40 μg/ml)加入含10%胎牛血清的培养基中,MTT法检测不同浓度维生素C对细胞增殖的影响。根据MTT检测结果选择最适浓度的维生素C诱导培养出细胞膜片,将膜片进行HE染色及扫描电镜检测。牙髓干细胞膜片为实验组,牙髓干细胞悬液为对照组。在膜片培养的14天,21天成骨能力的检测通过碱性磷酸酶染色以及Real-timePCR检测相关成骨基因ALP、OCN、BMP2、RUNX-2 的表达。结果 显微镜下观察牙髓干细胞从组织块边缘爬出通常需要5～7天。一般10～14d细胞可达80%汇合。hDPSCs表面标记物阴性表达血细胞相关标记物CD34(0.93%)、CD45(0.14%);阳性表达干细胞相关标记物 CD44(98.56%),CD90(98.11%),CD105(93.34%);符合间充质干细胞表面标记物特性。MTT结果提示牙髓干细胞的增殖的能力随不同浓度的维生素C发生变化。20 μg/mlVc对细胞的增殖有明显的促进作用(P<0.05)。40μg/mlVc对细胞的增殖有抑制作用(P<0.05)。使用20 μg/ml的Vc加入培养基中对细胞诱导培养2周后,可成功培养出完整的细胞膜片。使用倒置显微镜,HE染色,扫描电镜检测可见细胞排列紧密,呈复层生长,细胞周围存在大量的细胞外基质。ALP活性检测提示其随着时间增加,其ALP活性增强,实验组ALP活性强于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。q-PCR检测成骨相关基因提示,排除时间因素的影响,实验组成骨能力的表达始终强于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 适宜浓度Vc可成功制备出牙髓干细胞膜片,细胞膜片含有大量的细胞外基质可以更好的模拟细胞生存的微环境。膜片的成骨相关基因的表达量始终高于细胞悬液组。综上所述,细胞膜片有较高的成骨能力,更有利于牙周组织再生。本实验研究为牙周组织工程的临床研究提供基础。第二部分无血清培养下PRFe对牙髓干细胞增殖分化的影响目的 研究在无血清条件下,使用富血小板纤维蛋白提取液对人牙髓干细胞培养为实验组;常规使用10%胎牛血清培养人牙髓干细胞为对照组。比较两组增殖及分化的差异。为牙周组织工程中的临床应用提供理论基础。方法 将第一部分培养出的P2-P4代牙髓干细胞用于实验研究。实验组使用PRFe不含胎牛血清(FBS)的α-最低必须培养基,对照组使用含10%FBS的α-最低必须培养基。甲基噻唑基四唑法检测培养1、2、3...7d检测细胞增殖情况;24小时后使用台盼蓝检测两组细胞活性;通过碱性磷酸酶染色、Real-timePCR检测相关成骨基因 ALP、OCN、BMP2、RUNX-2 的表达。结果 倒置显微镜下观察两种培养基培养细胞形态相似,实验组的细胞形态更为纤长。台盼蓝染色显示24h后不同浓度PRFe、处理的实验组与10%FBS组,细胞活率均下降,实验组中随着PRFe浓度的升高活率增加。MTT检测提示不同培养基培养的hDPSCs生长曲线相似,均基本为S型。但PRFe培养的细胞其增殖能力弱于对照组(P<0.05)。PRFe能够在体外扩增培养牙髓干细胞并有一定的成骨分化能力,通过4天,7天,14天,21天四个时间点检测实验组成骨分化能力强于对照组(P<0.05)。结论 适宜浓度PRFe能够维持牙髓间充质增殖分化,PRFe培养的细胞其增殖能力弱于对照组,但其较高浓度PRFe培养的hDPSCs具有较强的增殖能力。PRFe可促进细胞的增殖分化,四个时间点中检测提示实验组的成骨能力均强于对照组。PRFe可取代FBS用于细胞治疗及生物医学研究。