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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)为金属依赖型β-脱羧脱氢酶(metal-dependentβ-decarboxylating dehydrogenases)超家族成员之一，是三羧酸循环中的关键酶，参与细胞能量代谢、供给还原力和碳骨架、维持细胞内氧化还原平衡、调节碳通量分配以及细胞抗逆作用，且人NADP+-依赖型IDH(NADP-IDH,EC1.1.1.42)的变异与肿瘤发生相关。IDH以NAD(P)+为辅酶，在二价金属离子(Mg2+或Mn2+)的激活作用下，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸、NAD(P)H和二氧化碳。根据辅酶特异性，可将IDH分为NAD+-依赖型IDH(NAD-IDH,EC1.1.1.41)和NADP-IDH；根据系统发生分析可将IDH家族蛋白分为3个亚家族：Type I IDH、Type II IDH和单体型IDH。 在本研究中，成功克隆了BlIDH基因，其全长1221 bp，共编码406个氨基酸，基于序列比对和系统发生分析，BlIDH为Type II IDH亚家族成员。纯化的重组BlIDH经SDS-PAGE和凝胶过滤层析检测，显示BlIDH的亚基分子量约为45 kDa，活性状态的分子量约为81.3 kDa，故为同源二聚体IDH。 酶学性质分析显示：以Mn2+为激活剂时，BlIDH的最适反应pH和最适反应温度分别为pH7.5和60 ℃；以Mg2+为激活剂时，最适反应pH和最适反应温度分别为pH8.0和65 ℃；BlIDH的热稳定性较差，48 ℃时的半衰期为20 min；BlIDH的活性依赖于二价金属离子的参与，Mn2+是最佳激活剂，Mg2+次之，而Zn2+、Cu2+、Ca2+、Li+等则会完全抑制BlIDH的活性。 酶动力学研究显示：以Mn2+或Mg2+为激活剂时，BlIDH对NADP+的Km值分别为58.29μM和19.45μM，对NAD+的Km值则分别为552.2μM和3584μM；BlIDH对NADP+的转换数与催化效率均要高于其对NAD+时的转换数与催化效率；以Mn2+或Mg2+为激活剂时，BlIDH对NADP+的偏好性([kcat/Km]NADP/[kcat/Km]NAD)分别是其对NAD+偏好性的193倍和567倍，故BlIDH为NADP+依赖性的Type II IDH。 基于上述实验结果，将BlIDH与其他NADP-IDH进行氨基酸序列比对发现，其辅酶结合位点的氨基酸非常保守。本研究通过氨基酸序列和模拟的晶体结构分析，确定了BlIDH辅酶特异性改造位点。采用定点突变技术构建了三个BlIDH突变体酶，分别为单点突变体酶R314D(R/D)、三点突变体酶R314D/H315I/T327A(T3)和六点突变体酶D253A/S257K/K260Q/R314D/H315I/T327A(T6)。酶动力学研究显示：与野生型BlIDH相比，R/D突变体酶对NADP+的亲和力下降了57倍，而对NAD+的亲和力无明显变化；在以NADP+为辅酶时，T3突变体酶没有活性，当以NAD+为辅酶时，其对NAD+的亲和力、转换数和催化效率均有所下降；T6突变体酶对NADP+的亲和力下降了17倍，对NAD+的亲和力提高了28倍，T6对NAD+的偏好性高于其对NADP+的偏好性，而且T6对NAD+的催化效率是野生型酶的8.5倍。故本研究成功实现了BlIDH的辅酶特异性转换。 长双歧杆菌是一种重要的工业益生菌，对其IDH酶学性质的鉴定可以为长双歧杆菌中相关代谢途径的研究奠定基础。对BlIDH辅酶特异性的改造，不仅验证了IDH家族蛋白中与辅酶结合相关的关键氨基酸残基的重要性，也为进一步探索IDH家族或β-脱羧脱氢酶超家族蛋白的功能进化机制提供了科学依据。