目的:喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,其发病率、死亡率较高,严重威胁着人民的生命健康。中医体质与肿瘤的发生发展有着密切的相关性,目前关于体质与喉癌发生发展相关性的研究并不多见,探究与喉癌发生相关的中医体质类型,对于临床中调整患者体质偏颇,预防喉癌有着重要的意义。导师团队经过20多年的研究,逐步发现并证实了痰瘀相关证候(血瘀证、痰证、痰瘀互结证)是喉癌形成的基本证型,揭示痰瘀相关证候与喉癌形成之间的基因学机制,有望为喉癌的药物治疗提供准确靶点。本课题将通过临床调查研究,探究喉癌患者的中医体质类型特点,为喉癌的早期预防提供依据;其次,将通过实验研究,观察痰瘀相关证候对喉癌裸鼠肿瘤生长的影响,并检测miRNA在痰瘀相关证候裸鼠肿瘤模型上的差异表达情况,分析痰瘀相关证候影响喉鳞癌细胞增殖的基因学机制。方法:1.文献研究通过文献回顾,总结中医体质的概念、分型、影响因素等,分析中医体质与发病的关系,回顾中医体质与恶性肿瘤关系的研究进展。2.临床研究根据国医大师王琦教授的"体质九分法"建立临床病例观察表,采用问卷调查法,根据严格的纳排标准,纳入喉癌组患者67例,来源于2014年1月-2017年2月期间在广州中医药大学第二附属医院就诊并确诊为喉癌的患者;对照组53例,来源于同期收集的广州市白云区三元里社区健康居民。对两组人群进行中医体质评分,建立数据库,判断两组人群的中医体质类型,分析喉癌患者的中医体质特点。3.实验研究将Hep-2喉鳞癌细胞进行培养、传代;制作痰瘀相关证候(血瘀证、痰证、痰瘀互结证)裸鼠模型,并对模型进行评价;将生长状态良好的Hep-2喉癌细胞接种到已造模成功的裸鼠右侧腋窝部皮下,观察各组裸鼠在体瘤生长情况;肿瘤取材后以MTT法检测细胞活性,以高通量法检测瘤体细胞中的miRNA表达情况,并通过实时定量PCR检测目的基因表达情况。成果:1.临床研究对67例喉癌患者及53例健康对照组人群进行中医体质分析,两组人群的体质类型总体比较有统计学差异(P<0.05),说明两组人群体质类型存在差异。同时,对每一体质类型分别进行比较,发现喉癌组瘀血质、痰湿质人数明显多于对照组(P<0.05),喉癌组平和质人数明显少于对照组(P<0.05)。九种体质类型中除平和质外,其余八种皆为偏颇体质。喉癌组中平和质7例,占本组总人数的10.4%,偏颇体质60例,占89.6%;对照组中平和质27例,占本组总人数的50.9%,偏颇体质26例,占49.1%。调查还发现,八种偏颇体质既可单独出现,也可与其他偏颇体质兼见,同时具有两种及以上偏颇体质者称为兼夹体质。喉癌组的60例偏颇体质中,属单一偏颇体质者27例,占40.3%,属兼夹体质者33例,占49.3%;对照组的26例偏颇体质中,属单一偏颇体质者11例,占20.80%,属兼夹体质者15例,占28.3%。喉癌组中瘀血质24例(包括单一瘀血质6例,瘀血质兼其他偏颇体质18例),对照组中瘀血质3例(包括单一瘀血质0,瘀血质兼其他3例),两者比较有统计学差异(P<0.05)。喉癌组中痰湿质25例(包括单一痰湿质3例,痰湿质兼其他22例),对照组中痰湿质6例(包括单一痰湿质0,痰湿质兼其他6例),两者比较有统计学差异(P<0.05)。其余六种体质类型(气虚质、阳虚质、阴虚质、湿热质、气郁质、特禀质)分别比较,无明显统计学差异(P>0.05)。气虚质、阳虚质、阴虚质为虚性体质类型,将两组虚性体质者分别合并后,各体质类型人数由多到少排序为:喉癌组,虚性体质>痰湿质>瘀血质>湿热质>气郁质>平和质>特禀质;对照组,平和质>虚性体质>湿热质>气郁质>痰湿质>瘀血质>特禀质。虚性体质者在两组人群中均占有较大比例,喉癌组46.3%,对照组32.1%。2.实验研究(1)完成了痰瘀相关证候(血瘀证、痰证、痰疲互结证)裸小鼠模型的制作和评价:与对照组比较,血瘀证组裸小鼠出现了形体消瘦,时有寒战,反应减弱,皮肤暗红无光泽,耳、爪、尾部等出现瘀点瘀斑,背部青筋显露,唇周暗红,舌色紫黯等表现,以及体重增长缓慢,摄食量、饮水量减少,尾出血时间和凝血时间(玻管法)显著缩短等症状体征和实验室指标的变化,符合血瘀证动物模型的特征性表现;痰证组裸小鼠出现了肥胖、行动迟缓、嗜卧少动、喜扎堆、大便黏腻不成形等表现,以及体重增长加快,摄食量、饮水量减少,血脂显著升高等症状体征和实验室指标的变化,符合痰证动物模型的特征性表现;痰瘀互结证组裸小鼠出现了形体稍胖,嗜卧少动,行动迟缓,蜷卧喜扎堆,皮肤暗红色,耳、爪、尾部出现瘀点瘀斑,背部青筋显露,唇周暗红,舌色紫黯,大便黏腻不成形等表现,以及体重增长缓慢,摄食量、饮水量显著减少,尾出血时间和凝血时间(玻管法)显著缩短,血脂显著升高等症状体征和实验室指标的变化,符合痰瘀互结证动物模型的特征性表现。(2)将喉鳞癌细胞接种到四组裸鼠腋窝部皮下后成功成瘤。观察各组裸鼠的在体瘤生长情况,血瘀证组裸鼠肿瘤生长速度较对照组加快,时间点出现在肿瘤接种后第20天(约第3周),痰证组、痰瘀互结证组裸鼠肿瘤生长速度与对照组比较无显著差异。肿瘤接种后第28天,三个模型组裸鼠的喉癌体积、喉癌重量与对照组比较,无显著差异(P>0.05)。(3)通过MTT实验检测不同模型组裸鼠在体喉癌细胞的活性,血瘀证组、痰证组、痰瘀互结证组裸鼠在体喉癌细胞活性均高于对照组(P<0.05)。(4)高通量法测序结果:血瘀证组、痰证组、痰瘀互结证组喉癌裸鼠的喉癌细胞中均出现mmiRNA异常表达。血瘀证组、痰瘀互结证组与对照组比较,血瘀证组、痰瘀互结证组与痰证组比较,均有大量miRNA表达上调或下调;而痰证组与对照组比较、血瘀证组与痰瘀互结证组比较,miRNA表达上调或下调数量相对较少。经去重复、文献回顾筛选后初步确定10个miRNA为血瘀证、痰证、痰瘀互结证影响喉癌裸鼠喉癌细胞miRNA异常表达的目的基因,经PCR检测证实有5个miRNA在模型组裸鼠喉癌细胞中出现显著异常表达,分别为 miR-27a-5p、miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p。血瘀证组、痰瘀互结证组与对照组比较异常表达的miRNA相同:miR-27a-5p 呈高表达;miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p 呈低表达。痰证组与对照组比较:miR-27a-5p呈高表达,miR-708-5p呈低表达。结论:1.临床研究喉癌患者中医体质类型以瘀血质、痰湿质为主,兼有较多虚性体质,据此推测喉癌的发生可能与瘀血质、痰湿质、虚性体质有关。2.实验研究血瘀证、痰证、痰瘀互结证可使喉癌细胞活性增强、促进喉癌细胞增殖;在体外成瘤实验中,血瘀证对喉癌细胞增殖促进作用更为显著;血瘀证、痰证、痰瘀互结证促进喉癌细胞增殖的基因学机制可能是通过使喉癌细胞中的miRNA发生异常表达实现的:血瘀证、痰证、痰瘀互结证可使miR-27a-5p表达上调,从而促进喉癌细胞增殖,推测mmiR-27a-5p可能为促进喉癌细胞增殖的基因;血瘀证、痰证、痰瘀互结证可使mmiR-708-5p 表达下调,血瘀证、痰疲互结证可使 miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p表达下调,从而使喉癌细胞的增殖失去抑制作用,促进喉癌的发展,推测miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p可能为抑制喉癌细胞增殖的基因。3.展望调整体质偏颇,改善瘀血质、痰湿质、虚性体质对预防喉癌有着重要的意义。在喉癌的治疗中,对血瘀证、痰证、痰瘀互结证的喉癌可有望通过"化痰祛瘀"法治疗,以抑制喉癌细胞的增殖,这对喉癌的临床治疗有重要的意义。