背景目前在我国,胃癌的死亡率和发病率居高不下。近年来,随着手术、新辅助化疗、靶向治疗等综合治疗的进步,胃癌患者的预后已经得到了初步改善,但大多数患者,尤其是进展期胃癌患者的预后仍较差。所以,对胃癌及癌前病变患者进行早期诊断和早期治疗,对提高其生存率、改善其预后具有重要意义。但是,目前还没有针对早期胃癌的精准的病理诊断标准。统计数据显示,我国早期胃癌的检出率尚不足10%,这表明早期胃癌的诊治还有很大的提升空间。胃癌的发生及进展是一个极其复杂的多步骤过程。具体过程可分为:正常胃粘膜—胃粘膜肠上皮化生—胃上皮内瘤变—胃癌。在这个过’程中,多种因素都可对其产生影响,导致很多病变的形态不典型;另外,大多数早期胃癌的病理诊断均基于胃镜活检小标本,不仅数量有限,而且观察视野有限,有时很难准确区分,导致同一例病理标本不同的病理工作者会做出不同的病理诊断。在我国,胃癌多为肠型胃癌。公认的Lauren分型,将胃腺癌分为肠型、弥漫型和混合型三种类型。与胃腺癌相关的胃上皮内瘤变以及胃粘膜内癌的早期诊断对胃癌患者的治疗及预后起着至关重要的作用。一直以来,胃粘膜低级别瘤变(low grade neoplasia,LGN)与非肿瘤性病变--例如肠上皮化生(intestinal metaplastic,IM)尤其是复杂肠化修复性增生之间的鉴别、胃粘膜高级别瘤变(high grade neoplasia,.HGN)与胃浸润性粘膜内癌(gastric intramucosal carcinoma,GIC)之间的鉴别均存在很大困难。病理学诊断在形态学上出现难以鉴别的情况时往往会参考相关分子指标检测来辅助诊断。分子检测指标的发展依赖于胃癌发生发展机制的相关信号通路的深入的研究。我们希望可以发现能帮助临床诊断,可以进一步明确癌前病变和早期胃癌,预测胃癌预后的实用指标。微小染色体维持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins,MCMs)是一组在真核生物中广泛存在的高度保守蛋白家族,与DNA复制密切相关。它主要参与DNA复制许可和控制细胞周期进展,是复制准许因子中的一个重要成员,因此,MCMs蛋白水平能够敏感而特异地反映细胞增殖程度。微小染色体维持蛋白7(mini-chromosome maintenance protein 7,MCM7)作为MCMs家族的一员,是MCMs蛋白复合体的一部分,是真核细胞DNA复制起始所必需的解旋酶。目前多项研究表明,MCM7参与调控细胞周期、影响转录和细胞增殖,与肿瘤形成密切相关,在多种恶性肿瘤中如前列腺癌、肝癌、食管癌、结肠癌等中均高表达。它可促进肿瘤增殖、抑制凋亡,还与上述多种肿瘤的转移显著相关,MCM7高表达预示着肿瘤患者的预后不良。但是,MCM7在胃癌中的表达和临床意义却很少被提及,其发挥作用的机制也尚不清楚。本研究的主要目的在于,检测MCM7在胃黏膜病变组织中及胃癌组织中的表达情况,并分析MCM7的表达和胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系,阐明MCM7对胃癌细胞增殖、浸润和迁移能力的影响,并探讨MCM7参与胃癌细胞浸润转移的可能调节机制。第一章MCM7在早期胃癌中的表达及其诊断意义研究目的:检测微小染色体维持蛋白7(MCM7)在不同病理阶段胃粘膜病变中的表达情况,明确其作为一种生物标志物在区分上皮内瘤变与胃粘膜病变中的作用,并探讨MCM7的表达是否与胃癌的多步骤进程有关。研究方法:纳入我院收治的93例患者的各类胃粘膜病变的病理标本作为研究对象。标本共分6组:胃炎组18例;肠上皮化生组16例;低级别上皮内瘤变l 1例;高级别上皮内瘤变8例;浸润性粘膜内癌13例;粘膜下浸润性癌27例。应用免疫组织化学方法检测各组标本中的MCM7和Ki67表达,用光学显微镜进行评分。细胞核MCM7和Ki67染色作为阳性。所得数据进行统计学分析。研究结果:胃炎组中MCM7和Ki67的表达低于其它组(P0.001),在肠上皮化生组中MCM7和Ki67的表达与其他组相比差异有统计学意义(P<0.001)。在胃浸润性腺癌中MCM7和Ki67表达最高(P<0.05)。在胃粘膜上皮内低级别瘤变、上皮内高级别瘤变和粘膜内癌组中MCM7表达差异无统计学意义(P>0.05)。Ki67表达显示胃粘膜低级别瘤变组和粘膜内癌组比较差异有统计学意义(P<0.05)。同时,MCM7表达随肿瘤分级升高而升高,与Ki67呈显著正相关(r=0.940,P<0.001)。而且在部分病例中,一些肿瘤细胞对MCM7有免疫反应,但对Ki67呈阴性。研究结论:MCM7表达有助于对胃黏膜病变的病理分级做由鉴别诊断,联合MCM7与ki67可作为评价癌前病变和早期胃癌的更为敏感的增殖标志物。同时,MCM7表达与胃癌的发生呈正相关,MCM7表达可能促进胃癌的发生发展。第二章MCM7对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用研究目的:研究MCM7在胃癌组织中的表达,分析MCM7与患者临床病理指标、患者总体生存率之间的关系;应用RNA干扰技术,构建靶向MCM7基因的siRNA,转染人胃癌细胞,观察敲除MCM7后,胃癌细胞增殖和侵袭、迁移能力的变化。研究方法:1.以58例胃癌患者的病理标本作为研究对象,制备蜡块后切片,免疫组化法检测MCM7蛋白在胃癌组织中的表达。计数肿瘤细胞MCM7核染色阳性细胞的百分比,据此分组,阳性细胞占计数细胞百分比≤50%为MCM7低表达,百分比>50%为MCM7高表达。分析MCM7的表达与患者临床病理特征、总体生存率之间的相关性。2.选用人胃癌细胞系MGC-803和人正常胃上皮细胞系GES-1,一方面通过siRNA干扰降低MCM7在胃癌细胞中的表达(siMCM7组和对照组NC),另一方面,反方向在胃上皮细胞中过表达MCNM7基因(dsMCM7组和对照组NC)。通过CCK-8试验、细胞平板克隆实验、Transwell试验、细胞划痕试验等方法检测正常胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为的变化。研究结果:1.MCM7主要表达于浸润性胃腺癌细胞的细胞核中:58例胃癌患者中MCM7低表达17例(29.3%),MCM7高表达41例(70.7%),说明在浸润性胃癌中,多数病例会出现MCM7高表达。同时,MCM7表达与胃癌淋巴结转移、TNM分期明显相关:在淋巴结转移组MCM7的表达显著高于无淋巴结转移组(P<0.001);TNM分期越高,其表达的程度越高(P=0.05)。术后总体生存率MCM7高表达的患者明显低于MCM7低表达的患者(P=0.018),说明MCM7高表达的患者预后差。2.CCK-8试验结果表明:沉默MCM7后,细胞增殖能力相比对照组明显降低,在48小时有明显抑制,差异具有统计学意义(p<0.0001);同样,在细胞克隆实验中,沉默MCM7后,细胞克隆数目显著降低,差异有统计学意义(p<0.0001)。划痕实验与Transwell实验结果也提示:相比对照组,siMCM7组的胃癌细胞的体外迁移和侵袭能力明显受到抑制。与之相反,在胃正常细胞中过表达MCM7后,CCK-8试验表明dsMCM7组增殖相比对照组明显升高,在48、72小时均有显著差异(P=0.0028,P<0.0001);细胞平板克隆实验观察到克隆数目显著升高,差异具有统计学意义(P<0.0001)。同时,划痕实验与Transwell实验结果也显示,过表达MCM7也可显著促进胃细胞的迁移及侵袭功能。研究结论:MCM7在胃癌中的表达与肿瘤分期及淋巴结转移相关,MCM7高表达的患者,其总体生存率较低。在体外下调胃癌细胞中MCM7的表达,可对胃癌细胞的增殖、侵袭及转移能力产生显著抑制。第三章MCM7对胃癌细胞EMT的影响及可能的机制研究目的:研究MCM7对上皮-间质转化(EMT)过程的作用以及调节EMT的可能机制,探讨MCM7影响胃癌细胞侵袭和转移的可能分子机制。研究方法:采用人胃癌细胞系MGC-803和人正常胃上皮细胞系GES-1,通过siRNA干扰技术降低MCM7在胃癌细胞中的表达,并反向在胃上皮细胞中过表达MCM7基因。采取Western Blot技术检测EMT相关因子E-cadherin、N-cadherin、和Vimentin等蛋白的变化;并进一步检测PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt、mTOR基因蛋白的表达变化。研究结果:1.EMT相关基因蛋白表达情况:胃癌细胞siMCM7组:上皮的标志物如E-cadherin的表达显著升高,间质的标志物如N-cadherin及Vimentin的表达明显降低。而在胃上皮细胞dsMCM7组:E-cadherin的表达显著降低,而N-cadherin及Vimentin的表达明显上调。2.PI3K/Akt/mTOR通路相关基因蛋白的表达:胃癌细胞siMCM7组中,PI3K蛋白表达降低,Akt和mTOR未见明显变化,而p-Akt和p-mTOR降低。而在胃上皮细胞dsMCM7组中,PI3K蛋白可见表达上调,Akt和mTOR无明显变化,.但p-Akt和p-mTOR可见表达上调。研究结论:MCM7表达与胃癌细胞EMT进程相关。并且MCM7可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路,来调控EMT相关基因的表达,进而最终影响胃癌细胞体外的侵袭和迁移。