胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase,COD）是一种多功能生物酶,属于黄素蛋白氧化还原酶,该酶是生物细胞代谢过程中胆固醇降解的重要酶,被广泛应用于临床检测,农业,食品检测等领域。本研究将短杆菌Brevibacterium sp.来源的胆固醇氧化酶基因（cod）在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达,研究了其酶学性质;对重组酶进行有机-无机杂化纳米花固定研究,考察了COD对不同底物的转化能力,并对产物进行了鉴定。（1）以含有Brevibacterium sp.来源cod基因的质粒pET28a-cod作为PCR模板,扩增cod基因,将其与质粒pRham^TM连接,并在宿主E.coli BL21（DE3）菌株中进行重组表达。使用7-氯-异咯嗪及黄素单核苷酸（FMN）为亲和配体填料的纯化柱进行纯化,获得比酶活25.23 U·mg^-1的纯酶。酶学性质测定显示胆固醇氧化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,经差式扫描量热分析（DSC）,得到酶半变性温度为60.5℃。对诱导条件进行优化,当诱导剂浓度为0.25%时,30℃诱导16 h,酶活为10.6 U·mL^-1,是未优化时的1.5倍。（2）通过有机无机金属杂化纳米花的方式对COD进行固定,无机载体选择Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺的水不溶性盐结晶,对固定化条件从不同酶浓度、不同金属离子浓度方面进行优化。Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺载体最终选择酶浓度为0.15 mg·mL^-1,金属离子浓度为1.6 mmol·L^-1,此外当0.1 mg·mL^-1 COD时,分别用0.8 mmol·L^-1 Ca²⁺、1.6mmol·L^-1的Fe³⁺进行后续实验。使用FE-SEM、DSC、XRD及FTIR等技术对固定化形成的纳米花进行表征及性质鉴定,并测定了固定化酶的酶学性质。发现当Cu²⁺、Ca²⁺和Zn²⁺为无机载体时,最优条件下最高比酶活分别是0.59 U·mg^-1、0.59 U·mg^-1及0.63U·mg^-1,而Mn²⁺、Fe³⁺比酶活相对较高分别为1.95 U·mg^-1,1.12 U·mg^-1。固定化酶的温度稳定性、pH稳定性及储存稳定性均比游离酶有很大提高。DSC测定其半变性温度由游离酶的60.5℃分别提升至138.49℃、167.02℃、167.02℃、160.99℃及172.85℃。（3）COD底物谱较为广泛,选取了胆固醇、豆甾醇、孕烯醇酮、麦角固醇、β-谷甾醇及脱氢表雄酮五种底物研究游离酶和固定化酶的底物特异性。发现COD对胆固醇、对孕烯醇酮、脱氢表雄酮、麦角固醇均有转化能力,并且产物单一。对转化的产物进行分离、纯化,通过LC-MS、NMR、FTIR等技术方法分析,确定产物分子量和结构式。