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蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物，属于生物毒素。根据蛇毒的不同组分及产生的不同生物效应，可将蛇毒分为蛇神经毒素、心脏毒素、肌肉毒素、细胞毒素以及系列酶类[1]。我国的蛇类资源十分丰富，其中具有剧毒且危害较大的有10余种，即眼镜蛇、眼镜王蛇、金环蛇、银环蛇等[2,3]。早在19世纪初就已证明蛇毒具有镇痛作用[4]。后来大量数据显示，蛇毒具有镇痛作用，而产生镇痛作用的成分主要是蛇毒中的神经毒素成分，且其镇痛作用具有镇痛时间长，无成瘾性、耐药性及用量少等特点，对顽固性神经性疼痛亦有效[5,6]。蛇毒神经毒素还具有诱导不同细胞凋亡的作用[7,8]。蛇毒的另一重要的成分为心脏毒素，它是由58-60个氨基酸组成，具有溶血、细胞毒性、以及肌肉去极化等药理学功能。其对肿瘤细胞特别是恶性肿瘤显示较好的溶解作用，可能成为一个极具潜力的抗肿瘤药物[9]。本课题组其他成员已经成功地从中华眼镜蛇中提取分离了一种心脏毒素najanalgesin，并首次通过大鼠神经性疼痛模型实验证实了najanalgesin的镇痛作用，脊髓的阿片受体以及M受体参与介导其镇痛作用；后来的研究显示，najanalgesin的镇痛作用与脊髓星形胶质细胞MAPK信号家族相关性大。
而且已有数据显示，脊髓的星形胶质细胞在慢性疼痛方面扮演重要的角色可能通过p38-MAPK系统产生的[10,11]。
因此，本研究主要目的是：在细胞水平探讨中华眼镜蛇成分najanalgesin的镇痛作用与脊髓星形胶质细胞p38MAPK信号通路的相关性，阐明najanalgesin镇痛作用机制，最终为中华眼镜蛇成分najanalgesin的临床研究提供理论依据，提高疼痛治疗的有效性、安全性和经济性。研究共分为以下三个部分。
一、SD大鼠原代脊髓星形胶质细胞培养模型的建立和验证
目的：建立SD大鼠原代脊髓星形胶质细胞培养模型，为下一步药物诱导实验提供一定数量的正常细胞并摸索药物干预实验的药物浓度。
方法：参照McCARTHY建立的方法，并与差速贴壁法和阿糖胞苷方法比较后，成功建立了简单易行而且经济的大鼠原代脊髓星形胶质细胞培养模型。胎盼蓝染色后观察存活率，记录细胞数量。并采用免疫细胞荧光化学法对星形胶质细胞的特异性标记物GFAP进行标记鉴定纯度，激光共聚焦观察并摄像记录，计算原代培养的纯度。MTT法测定不同浓度梯度药物najanalgesin孵育细胞后的OD值，根据najanalgesin对细胞的增殖抑制作用数据确定进行药物诱导实验的浓度。
结果：
1.SD大鼠原代脊髓星形胶质细胞存活率在75％-85％。每6只出生1-3天的SD大鼠能够得到2-4×106个细胞；免疫细胞荧光化学法鉴定细胞纯度均为98％以上，培养所得的星形胶质细胞产率和纯度理想。@22.Najanalgesin对脊髓星形胶质细胞生长增殖有抑制作用。当药物najanalgesin浓度为0.01-10μg/ml时，其对细胞的毒性以及增殖作用均与空白组相当；当药物浓度大于10μg/ml时，随着najanalgesin浓度的增加，其对星形胶质细胞的毒性以及增殖抑制作用都增大。
结论：采取了简单易行而且经济的方法，成功建立SD大鼠原代脊髓星形胶质细胞培养模型，可为下一步的实验提供一定数量的正常细胞。选择采用2μg/ml浓度的najanalgesin与细胞共同孵育，进行药物诱导实验。
二、SB203580及najanalgesin对LPS诱导的脊髓星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的影响
目的：研究SB203580及najanalgesin对LPS诱导的脊髓星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β的影响
方法：将细胞接种到24孔板中，无血清DMEM、LPS(2ug/ml)分别与细胞共孵育24h，而SB203580(20uM)和najanalgesin(2ug/ml)则预先孵育细胞15分钟，再与LPS联合孵育细胞。进行以上三种药物干预实验1h、12h及24h后，收集细胞上清，采用相应的ELISA试剂盒检测不同处理组细胞上清中TNF-α、IL-1β的含量。
结果：DMEM、LPS(2ug/ml)、SB203580(20uM)和najanalgesin(2ug/ml)对大鼠脊髓星形胶质细胞分泌IL-1B和TNF-α影响结果如下(pg/ml)：(A:DMEM；B:LPS；C:SB203580；D:Najanalgesin)Dataaremean±SD，*P＜0.05vsB
结论：LPS能显著诱导脊髓星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β；SB203580及najanalgesin能够抑制LPS诱导的脊髓星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β。
三、SB203580及najanalgesin对LPS诱导的脊髓星形胶质细胞磷酸化p38MAPK表达的影响
目的：研究SB203580及najanalgesin对LPS诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞中P-p38MAPK蛋白表达的影响，并比较其中的差异。
方法：将细胞接种到6孔板中，待细胞基本融合，无血清DMEM、LPS(2ug/ml)分别与细胞共孵育24h，而SB203580(20uM)和najanalgesin(2ug/ml)则预先孵育细胞15分钟，再与LPS联合孵育细胞。提取细胞总蛋白，Western-blotting检测P-p38MAPK蛋白的表达量。
结果：DMEM、LPS(2ug/ml)、SB203580(20uM)和najanalgesin(2ug/ml)对大鼠脊髓星形胶质细胞中P-p38MAPK表达影响结果如下：(A:DMEM；B:LPS；C:SB203580；D:Najanalgesin)Dataaremean±SD，**P＜0.01vsB
结论：LPS能显著提高脊髓星形胶质细胞P-p38MAPK蛋白的表达；SB203580以及najanalgesin能抑制LPS诱导的脊髓星形胶质细胞P-p38MAPK蛋白表达，提示najanalgesin通过p38MAPK信号通路调节星形胶质细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β，并对疼痛产生抑制作用。
本研究证实了LPS能显著诱导脊髓星形胶质细胞中P-p38MAPK蛋白表达并诱导星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β细胞因子；系统阐述了SB203580、najanalgesin和LPS对大鼠脊髓星形胶质细胞P-p38MAPK的影响，其中LPS对星形胶质细胞是诱导作用，而SB203580及najanalgesin则能抑制LPS诱导脊髓星形胶质细胞表达P-p38MAPK和分泌TNF-α、IL-1β，这与星形胶质细胞在脊髓中枢对痛觉的调控有关。这些结果提示，najanalgesin通过抑制p38MAPK信号通路来减弱脊髓星形胶质细胞对TNF-α、IL-1β的分泌作用，进而发挥其镇痛作用。本研究可为najanalgesin的镇痛作用机制的进一步阐述提供参考信息和理论基础。关键词：镇痛Najanalgesin星形胶质细胞p38促分裂原活化蛋白激酶