研究背景及目的:白癜风是由表皮黑素细胞减少或功能障碍引起的获得性皮肤色素脱失症,全球范围内的发病率为0.5%～1%,是引起皮肤色素脱失最常见的原因之一。白癜风的发病机制目前尚不清楚,主要包括遗传因素、自身免疫、神经精神因素、微量元素缺乏等。作为损容性皮肤病的一种,白癜风常伴发抑郁、焦虑等心理问题及社会适应不良,严重影响患者生活质量。目前白癜风的治疗主要以外用糖皮质激素及紫外线光疗为主,对于一些药物抵抗的白癜风类型,治疗仍比较棘手。促进皮损处残存的黑素细胞合成黑素或补充正常黑素细胞是治疗白癜风的重要策略。黑素合成是酪氨酸在黑素细胞的黑素小体内经历一系列化学反应生成黑素多聚物,转运至周围角质形成细胞核表面,从而抵御细胞内部及外界刺激的过程,是皮肤光保护和诸多色素性皮肤病发生的关键环节。黑素合成主要受到来自体内外多种因素的调节,其中外部因素主要为紫外线等,内部因素来自黑素细胞自身(包括酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白等)、周围细胞(主要是角质形成细胞)、内分泌、神经及免疫方面。调节黑素合成的信号通路包括c AMP/PKA(Cyclic Adenosine Monophosphate/Protein Kinase A环磷酸腺苷/蛋白激酶A)、Wnt及MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase丝裂原活化蛋白激酶)等。cAMP激活的交换蛋白(Exchange Protein Activated by c AMP,EPAC)是上世纪90年代新发现的c AMP效应蛋白,具有鸟苷酸交换活性,可参与多种病理生理过程,包括腺体分泌、细胞间黏附、伤口愈合、炎症、纤维化及肿瘤细胞转移等,其作用还在持续更新中。EPAC上游接受c AMP活化,下游同调节黑素合成的MAPK家族多位成员相联系,更有研究者将其比作c AMP通路与MAPK通路之间的桥梁。我们推测EPAC可能同黑素细胞黑素合成有关。此外,EPAC下游的Rap蛋白在角质形成细胞炎症因子的分泌过程中发挥作用,而这些炎症因子也是调节黑素合成的重要旁分泌因素,我们科学假设EPAC还可能通过改变角质形成细胞的分泌特性,对黑素细胞-角质形成细胞共培养体系中黑素细胞的黑素合成产生间接影响。小分子化合物I942(后简称I942)属于非环状核苷酸类的EPAC1选择性激动剂,I942被证实在人脐带血管内皮中可改变同微管稳定性及细胞周期进程相关的基因表达,我们的前期研究还发现,I942可通过c AMP-EPAC通路在伤口愈合、瘢痕形成多种病理生理过程中发挥作用,包括促进成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白细胞介素6的分泌,还可促进角质形成细胞角蛋白19的分泌及角质形成细胞迁移等,本课题拟研究I942对PIG1黑素细胞黑素合成功能影响及相关机制,并通过HaCaT角质形成细胞培养液上清培养PIG1黑素细胞的方式,研究I942通过调节HaCaT角质形成细胞的分泌活动对PIG1黑素细胞黑素合成的影响及相关的分子机制,从而对小分子化合物I942运用于临床治疗白癜风等色素性皮肤病及改进黑素细胞体外培养技术的可能性进行探索。本课题主要包括以下三个部分:第一部分小分子化合物I942对PIG1黑素细胞及HaCaT角质形成细胞增殖活力的影响方法:1.使用多巴染色法对PIG1黑素细胞进行鉴定。2.使用CCK8法检测小分子化合物I942对PIG1黑素细胞及HaCaT角质形成细胞增殖的影响。结果:1.使用0.1%的多巴溶液对黑素细胞进行染色后,细胞呈现棕黑色,证明PIG1黑素细胞是具有多巴氧化活性的正常黑素细胞。2.使用0～50μmol/L不同浓度的小分子化合物I942分别处理PIG1黑素细胞和HaCaT角质形成细胞,两种细胞的增殖未发生明显改变。第二部分小分子化合物I942对PIG1黑素细胞黑素合成功能的影响及机制研究方法:1.使用氢氧化钠裂解法及多巴氧化法检测小分子化合物I942及EPAC抑制剂ESi-09预处理后对于PIG1黑素细胞黑素含量和酪氨酸酶活性的影响。2.qPCR技术检测I942对PIG1黑素细胞中小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-Associated Transcription Factor,MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrosinase-Related Protein 1,TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase-Related Protein 2,TRP-2)基因的m RNA表达水平的影响。3.免疫蛋白印迹法检测I942对PIG1黑素细胞中TYR、TRP-2蛋白表达水平的影响。结果:1.小分子化合物I942可使PIG1黑素细胞内黑素含量及酪氨酸酶活性显著升高,使用EPAC抑制剂ESi-09预处理后,原有的上升作用有所减轻。2.小分子化合物I942可显著上调PIG1黑素细胞中MITF、TYR、TRP-1及TRP-2 m RNA表达水平。3.小分子化合物I942对PIG1黑素细胞中TYR及TRP-2蛋白表达水平未有明显影响。第三部分小分子化合物I942通过HaCaT角质形成细胞对PIG1黑素细胞黑素合成的影响及机制研究方法:1.使用氢氧化钠裂解法及多巴氧化法检测小分子化合物I942及EPAC抑制剂ESi-09预处理后通过HaCaT角质形成细胞对PIG1黑素细胞黑素含量及酪氨酸酶活性的影响。2.qPCR检测小分子化合物I942及ESi-09预处理后通过HaCaT角质形成细胞对PIG1黑素细胞中MITF、TYR、TRP-1及TRP-2 m RNA含量的影响。3.免疫蛋白印迹检测小分子化合物I942及ESi-09预处理后通过HaCaT角质形成细胞对PIG1黑素细胞中TYR及TRP-2蛋白水平的影响。结果:1.小分子化合物I942可通过HaCaT角质形成细胞降低PIG1黑素细胞的黑素含量及酪氨酸酶活性。使用EPAC抑制剂ESi-09预处理后,原有的降低作用可被减轻。2.小分子化合物I942可通过HaCaT角质形成细胞降低PIG1黑素细胞中MITF、TYR、TRP-1基因m RNA含量。使用EPAC1抑制剂ESi-09预处理后,原有的降低作用可被抑制。而TRP-2 m RNA表达量无明显变化。3.小分子化合物I942可通过HaCaT角质形成细胞降低PIG1黑素细胞中TYR蛋白表达水平,使用EPAC抑制剂ESi-09预处理后,原有的降低作用可被抑制,而TRP-2蛋白表达水平无明显变化。结论:1.小分子化合物I942在0～50μmol/L的浓度范围内对PIG1黑素细胞及HaCaT角质形成细胞的增殖无抑制作用。2.小分子化合物I942可增加PIG1黑素细胞黑素合成及酪氨酸活性,并上调转录因子MITF及TYR、TRP-1、TRP-2等黑素合成相关蛋白m RNA水平,而对TYR及TRP-2蛋白的影响不显著。3.小分子化合物I942可通过HaCaT角质形成细胞轻微下调PIG1黑素细胞黑素含量及酪氨酸酶活性,使用ESi-09预处理后,对黑素含量及酪氨酸酶活性的下调作用有所减弱。小分子化合物I942还可通过HaCaT角质形成细胞下调PIG1黑素细胞中MITF、TYR、TRP-1基因m RNA表达水平,使用ESi-09预处理后,对MITF、TYR、TRP-1 m RNA的下调作用可减轻。小分子化合物I942还可通过HaCaT角质形成细胞下调TYR蛋白表达水平,加入ESi-09预处理后后,原有对TYR蛋白含量的下调作用减轻,而对TRP-2蛋白表达的影响不明显。