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背景神经干细胞(neural stem cells)原位激活是指脑组织内的成体NSCs在受到某种活性物质的激活后而出现增殖、迁移、分化的现象,这种内源性NSCs原位激活为干细胞来源以及神经修复开创了新途径。研究发现脑损伤后NSCs原位激活、增殖、迁移和分化与谷氨酸受体NMDA受体的表达有密切相关性。NSCs的增殖和分化受多种因素调控,而非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801(地佐环平/地卓西平)对大鼠内源性NSC的增殖与分化有抑制作用。探索成体NSCs增殖激活信号通路分子机制具有重要意义。本课题分两部分：第一部分神经干细胞培养及鉴定目的将SD (Sprague-Dawley)大鼠神经干细胞进行体外原代培养以及传代培养后,对其增殖的神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞给予鉴定。为下一步研究神经干细胞增殖分化信号传导通路提供干细胞。方法从出生2天内SD新生大鼠海马中分离出神经干细胞进行体外原代培养,细胞分离液accutase消化后进行传代培养,各代神经干细胞增殖情况用CCK-8试剂检测；取第3代神经干细胞以及诱导分化培养的细胞进行鉴定,采用免疫荧光共聚焦技术检测神经干细胞特异性标记物nestin(巢蛋白),神经元标记物βⅢ-tubulin和星形胶质细胞标记物GFAP,从而对神经干细胞和分化后的神经元、胶质细胞给予鉴定。结果体外培养的神经干细胞分裂生长后形成干细胞球,且传代生长情况良好,选取第3代、5代、7代神经干细胞进行CCK-8细胞活性检测,各代神经干细胞的增殖结果示：24h各代神经干细胞数分别为38675±2480,45105±2405,41259±3419；48h各代细胞数分别为67597±3965,70148+2000,68001±1125；72h各代细胞数分别为139641±3456,140890±3092,140314±2884；96h第各细胞数分别为139164±4497,156602±708,156159±4253。对各代神经干细胞进行免疫荧光检测,结果显示神经干细胞特异性标志物巢蛋白nestin呈阳性表达；利用5%血清诱导分化培养后,免疫荧光共聚焦技术检测到神经干细胞分化为神经元的标志物βⅢ-tubulin和星形胶质细胞的标志物GFAP呈阳性表达。结论经免疫荧光及共聚焦技术鉴定,成功从成体SD大鼠海马齿状回分离并培养出神经干细胞。第二部分MK-801在Shh-谷氨酸信号传导通路中的阻断作用目的利用MK-801对大鼠NSCs谷氨酸受体的阻断作用,观察NSCs中的Shh(sonic hedgehog)及相关标志物的mRNA和蛋白表达的情况,探讨内源性神经干细胞原位激活机制。方法取第3代神经干细胞,消化为单细胞悬液后,随机分成7组,使MK-801的浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM,各浓度MK-801作用下连续培养7天,采用倒置显微镜下细胞计数和cck-8试剂检测活性细胞数分别检测0-160μM浓度的MK-801作用下神经干细胞增殖情况；将单细胞悬液随机分成空白对照组,谷氨酸组,MK-801组以及谷氨酸、MK-801共同处理组,各组神经干细胞经过相应处理后进行培养,通过western blot、RT-PCR以及实时荧光定量PCR技术分别在蛋白表达水平、基因表达水平了解神经干细胞增殖以及分化过程中信号通路的shh、Nestin、βⅢ-tubulin、GFAP的表达情况。结果神经干细胞在0-160μ M浓度MK-801组中连续悬浮培养7天后,倒置显微镜下进行细胞计数,结果示10μ M以上浓度组细胞数量明显减少,5u M组细胞数量比接种数量多,但比空白对照组细胞数量少；CCK-8连续测量各浓度细胞活性,结果示第2天后各组活性细胞数(单位为105个/ml)分别为1.516±0.084,1.384±0.154,0.937±0.035,0.837±0.020,0.824±0.008,0.866±0.008,0.842±0.008,7.207±0.317,随着时间延长10-160μ M浓度组神经干细胞数量持续减少,5μ M组细胞细胞数量持续增加,生长趋势与空白对照组类似；空白对照组,谷氨酸组,共同处理组以及MK-801组,western blot结果显示：四组Shh/GAPDH灰度值之比分别为空白对照0.115,谷氨酸组0.1239,共同处理组0.047,MK-801组0.03629；Nestin/GAPDH空白对照0.7625,谷氨酸组0.9915,共同处理组0.01871,MK-801组0.29050.115;(FAP/GAPDH灰度值之比分别为空白对照0.7625,谷氨酸组0.9915,共同处理组0.01871,MK-801组0.2905；βⅢ-tubulin/GAPDH灰度值之比分别为空白对照0.598,谷氨酸组0.8834,共同处理组0.0246,MK-801组0.0308。RT-PCR结果示在阻断剂MK-801作用后,MK-801组及联合处理组shh、Nestin、βⅢ-tubulin、 GFAP基因和蛋白表达明显抑制,且两组表达基本一致；谷氨酸组表达明显高于正常对照组。实时荧光相对定量结果显示：四组中ShhmRNA相对于空白对照组的表达水平分别为MK-801处理组0.00381,共同处理组0.00106,谷氨酸组shh基因表达量为空白对照组的5.195倍；基因nestin在谷氨酸组aestin表达量是空白对照组的7.61倍,在共同处理组及MK-801组分别为空白对照组的0.0067、0.0042倍；GFAPmRNA表达量,谷氨酸组是空白对照组的4.6913倍,而共同处理组和MK-801组的表达量分别为于空白对照组；MK-80I组βⅢ-tubulin的基因表达量是空白对照组的0.00165倍。共同处理组是对照组的0.0102374倍。谷氨酸组βⅢ-tubulin的基因表达量是相对于空白对照组的2.615倍。结论MK-801在10μ M及以上浓度可有效抑制神经干细胞增殖；在蛋白表达、基因表达层面上,MK-801能阻断NSCs经谷氨酸/]NMDAR-Shh信号传导的增殖分化通路。