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水稻作为人类主要的粮食作物,对水稻雄性不育的相关研究是作物杂种优势利用的主要途径,所以对其花药特别是绒毡层和花粉发育的深入研究有重要的理论意义和应用价值。β?-COP蛋白是COPI(Coat Protein I-Coated Vesicles)的亚基之一,COPI有被小泡属于运输被膜小泡的一种,参与细胞中蛋白质的运输。
β’-cop在水稻中存在三个拷贝,本实验前期研究中,获得纯合和杂合的β’-cop干涉植株,同时发现β’-cop在水稻穗部特异表达,其表达量高于水稻的其他组织并且影响了水稻结实率。本研究通过、细胞学和遗传学等方法,研究了β’-cop在水稻花药发育中的作用,并对其调控水稻花药发育的分子机理进行讨论。主要研究结果如下:
1.通过qRT-PCR检测了β’-cop的时空表达特异性,结果表明β’-cop在所检测到的器官中均有表达,其中在水稻的小穗各时期的表达量都较高,且在S6和S11时期的颖花中表达量相对更高。
2.对β’-co p干涉植株中β’-cop的表达量进行验证,发现干涉植株中β’-cop的表达量的确发生了大幅度的下调。对β’-cop干涉植株的表型观察发现,相对于野生型ZH11,β’-cop干涉植株的花药偏白色并且瘦小,伴随着不同程度的卷曲,可染率和结实率均下降明显。因而推测β’-cop在水稻花药发育中发挥重要功能。
3.通过花药半薄切片观察,对β’-cop干涉植株的花药发育过程进行研究,发现突变体花药发育在 S6时期花药壁细胞四层分化正常,但是绒毡层异常肿大并且开始出现大液泡,细胞之间的边界开始变模糊,绒毡层肿胀的状态一直持续到 S10时期。在S10时期时,花药药壁中的绒毡层和中层均没有出现降解现象,证明β’-cop表达的下降影响绒毡层和中层的正常降解过程。
4. S9和S10时期的花药超薄切片透射电镜观察发现,干涉植株S9时期绒毡层细胞内切向壁变得不连续呈现出松散状态,而S10时期绒毡层细胞中的细胞器保持活跃状态,细胞质中仍存在内质网残留,且绒毡层细胞表面的乌氏体出现不连续、结构松散、环状不明显且呈颗粒状,证明β’-cop表达的下降影响绒毡层细胞降解和孢粉素的正常形成。
5.通过TUNEL实验检测野生型ZH11和β’-cop干涉植株花药发育过程中绒毡层PCD的信号。结果发现,干涉植株在S6时期绒毡层的凋亡信号提前出现,表明β’-cop影响绒毡层PCD过程。
6.通过RNA-seq检测发现,在β’-cop干涉植株中优先表达在绒毡层中的基因有60%发生了显著性差异,其中已报道的与水稻绒毡层细胞发育的调控网络中的调控因子中直接作用与绒毡层细胞程序性死亡的OsAP25、OsAP37和DPW基因,以及调控绒毡层细胞发育的关键基因TDL1、TIP2、TDR、EAT1、PTC1和DTC1,这些基因在干涉植株中都有显著下调。且水稻中已报道有关孢粉素合成及运输至小孢子外壁相关的基因OsC6、DPW、C YP703A3、CYP704B2和OsABCG15/P DA1的表达量也显著下调。这表明β’-cop的下调影响绒毡层发育的基因表达以及孢粉素合成和运输相关的基因表达。
β’-cop在水稻中存在三个拷贝,本实验前期研究中,获得纯合和杂合的β’-cop干涉植株,同时发现β’-cop在水稻穗部特异表达,其表达量高于水稻的其他组织并且影响了水稻结实率。本研究通过、细胞学和遗传学等方法,研究了β’-cop在水稻花药发育中的作用,并对其调控水稻花药发育的分子机理进行讨论。主要研究结果如下:
1.通过qRT-PCR检测了β’-cop的时空表达特异性,结果表明β’-cop在所检测到的器官中均有表达,其中在水稻的小穗各时期的表达量都较高,且在S6和S11时期的颖花中表达量相对更高。
2.对β’-co p干涉植株中β’-cop的表达量进行验证,发现干涉植株中β’-cop的表达量的确发生了大幅度的下调。对β’-cop干涉植株的表型观察发现,相对于野生型ZH11,β’-cop干涉植株的花药偏白色并且瘦小,伴随着不同程度的卷曲,可染率和结实率均下降明显。因而推测β’-cop在水稻花药发育中发挥重要功能。
3.通过花药半薄切片观察,对β’-cop干涉植株的花药发育过程进行研究,发现突变体花药发育在 S6时期花药壁细胞四层分化正常,但是绒毡层异常肿大并且开始出现大液泡,细胞之间的边界开始变模糊,绒毡层肿胀的状态一直持续到 S10时期。在S10时期时,花药药壁中的绒毡层和中层均没有出现降解现象,证明β’-cop表达的下降影响绒毡层和中层的正常降解过程。
4. S9和S10时期的花药超薄切片透射电镜观察发现,干涉植株S9时期绒毡层细胞内切向壁变得不连续呈现出松散状态,而S10时期绒毡层细胞中的细胞器保持活跃状态,细胞质中仍存在内质网残留,且绒毡层细胞表面的乌氏体出现不连续、结构松散、环状不明显且呈颗粒状,证明β’-cop表达的下降影响绒毡层细胞降解和孢粉素的正常形成。
5.通过TUNEL实验检测野生型ZH11和β’-cop干涉植株花药发育过程中绒毡层PCD的信号。结果发现,干涉植株在S6时期绒毡层的凋亡信号提前出现,表明β’-cop影响绒毡层PCD过程。
6.通过RNA-seq检测发现,在β’-cop干涉植株中优先表达在绒毡层中的基因有60%发生了显著性差异,其中已报道的与水稻绒毡层细胞发育的调控网络中的调控因子中直接作用与绒毡层细胞程序性死亡的OsAP25、OsAP37和DPW基因,以及调控绒毡层细胞发育的关键基因TDL1、TIP2、TDR、EAT1、PTC1和DTC1,这些基因在干涉植株中都有显著下调。且水稻中已报道有关孢粉素合成及运输至小孢子外壁相关的基因OsC6、DPW、C YP703A3、CYP704B2和OsABCG15/P DA1的表达量也显著下调。这表明β’-cop的下调影响绒毡层发育的基因表达以及孢粉素合成和运输相关的基因表达。