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生孢噬纤维菌是能够降解纤维素的滑动细菌,对纤维素有着较强的降解作用,但是其纤维素降解特性一直缺乏深入的研究,本论文对生孢噬纤维菌JL—01的固液培养特性、发酵过程中pH值和糖含量变化的测定、酶活测定方法的总结、产酶条件的优化和FPase的分离纯化进一步阐明Sporocytophagasp.JL—01对纤维素的降解机制。实验结果具体如下:
1.在生孢噬纤维菌JL—01滤纸纤维素固体平板培养的过程中,168小时发现滤纸已经完全被分解。在CF11纤维素粉固体平板培养的过程中,CF11纤维素粉在192小时几乎被完全降解。滤纸纤维素液体培养的过程中,144小时滤纸完全被分解。无论是固体培养还是液体培养,JL—01对滤纸的降解效果要好于SD—02。
2.Sporocytophagasp.JL—01和SD—02在进行滤纸纤维素液体培养时,PH值都有上升的现象,并且发酵液中无还原糖的产生,而且发酵液总糖含量在不断的增加,前两种现象与纤维素霉菌发酵时是完全不同的,这说明在Sporocytophagasp.JL—01和SD—02在发酵过程中,可能是由于大量的碱性物质的生成导致pH的上升,并且有可能存在着特殊的糖代谢途径;在以葡萄糖为碳源液体发酵时,pH值都有下降的现象。综合Sporocytophagasp.JL—01和SD—02在液体发酵的现象,说明两株菌在分别以滤纸纤维素和葡萄糖为唯一碳源时,糖代谢的途径也不相同,这样造成了pH值上升和下降以及发酵液中还原糖检测不到的现象。原因可能是因为碳源不同,菌体所产的酶系也不同。
3.在FPase酶活测定过程中考察了酶液与缓冲液比例、酶解反应时间长短、pH大小、滤纸处理与否对产生还原糖的影响,并且确定了酶液与缓冲液比例为1:1、反应时间为2小时、pH值为7、以处理过的滤纸为底物时可以检测到FPase的酶活。由于方法的原因而未能检测到还原糖的存在就说纤维素细菌不存在FPase是不科学的。并且在酶活的测定过程中发现CMCase最适pH值是5.0,FPase的最适pH值是7.0,从酶学性质上来讲,可以猜测Sporocytophagasp.JL—01纤维素酶系可能是由酸性纤维素酶和碱性纤维素酶共同组成的。
4.在Sporocytophagasp.JL—01最佳产FPase条件的优化的过程中,从时间、接种量、温度、pH值、摇床转数五个因素对Sporocytophagasp.JL—01进行了最佳产FPase条件的优化,旨在为后续的FPase分离纯化工作提供充足的FPase粗样,因为FPase酶活性的低值有可能是因为此胞外酶含量极少的原因,优化结果为接种量为5%,培养温度30℃,pH值7.2,摇床转数为120r/min,培养时间120h,并按照此优化结果进行重复实验,实验结果好于优化前结果。
5.在FPase分离纯化的过程中,粗酶液经过超滤浓缩后,采用了硫酸铵和CTAB对样品的联合处理方法,再经过SepharoseCL-6B制备柱的处理,除去了杂蛋白和大部分的杂多糖。最后经分析用Sephacryls-100和DEAE—SephadexG-50得到单一组分,收集组分透析冻干进行电泳分析和酶学性质分析,电泳结果为FPase为单一条带,分子量为55.4KD,酶学的性质为FPase最适反应pH值为7.2,在pH值6.8-7.4范围内稳定,该酶最适反应温度为50℃,在30℃-50℃稳定,2n2+和Co2+对FPase活力有一定的促进作用,Fe3+对它有很强的抑制作用,而Ca2+、Mg2+和Na+对酶活力基本没有影响。
在实验过程中考察了FPase对底物专一性的研究,FPase对CMC也有一定的催化能力,且与滤纸酶活的比值近10:1,这就说明了在滤纸的降解过程中,此酶组分存在着双功能的作用,一方面对结晶区纤维素的催化能力并且从纤维素的两端切下二糖单元,另一方面又能发挥水解非结晶区的作用,可以猜测FPase在结构上有着多个功能域(或者说是一个双功能酶)(endoglucanase和CBH),它们共同协同从而达到高效降解纤维素的作用。使从滤纸降解的速率方面考虑,此酶具有高效性和多功能性的特点。由此可以推断,在细菌FPase酶活的测定当中,由于实验方法的原因测不到FPase酶活而断定无FPase是不科学的。实验结果说明此酶具有双功能的作用。从而进一步揭示了Sporocytophagasp.JL—01降解纤维素的机制。