苔藓植物是陆生植物中最原始的类群,在适应水生到陆地环境的过程中积累了丰富的次生代谢产物,主要包括联苄、黄酮、苯丙素及香豆素类化合物,这些化合物的甲基化修饰需要氧甲基转移酶的参与,以生成各种苯环上含氧甲基的产物。通常认为,木质素是植物为了适应陆生环境而进化的结果,细胞壁中包含木质素的G或0/S部分是陆生植物的一个特征。因此,我们猜测在叶苔中存在与类木质素化合物或木质素合成相关的氧甲基转移酶。植物氧甲基转移酶(O-methyltransferases, OMTs)催化的甲基化反应是植物次生代谢产物合成过程中普遍存在的一种烷基化反应,由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)提供的甲基转移到酚羟基后,生成氧甲基化产物和S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine, SAH)。植物OMTs分为两类,一类是依赖Mg2+的Ⅰ型OMT,分子量大约23-29 kDa,早期研究发现该类酶主要以脂酰辅酶A为特异性底物,命名为咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferase, CCoAOMT),随着研究的深入发现其亚类CCoAOMT-like酶还可以催化各种黄酮、花青素、香豆素和苯丙素类化合物的甲基化。另一类是不需要Mg2+的Ⅱ型OMT,该类酶通常命名为咖啡酸氧甲基转移酶(Caffeic acid O-methyltransferase, COMT),但它可催化的底物包括咖啡酸、香豆素及各种黄酮和生物碱类化合物。CCoAOMTs参与苯丙素类化合物的甲基化及木质素的生物合成,并存在于多种高等植物中。目前已从多种植物中克隆得到并鉴定CCoAOMT,例如：苜蓿、拟南芥、冰叶日中花、白杨和香草兰等。已研究的CCoAOMT多数来源于含有维管组织的高等植物,而苔藓植物和蕨类植物中的CCoAOMT极少被鉴定。实验室构建了钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)的cDNA文库进行EST测序,并进行了转录组测序。通过分析钝鳞紫背苔的两个数据库,得到两个同源性较高,注释为咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因的序列,分别命名为PaOMT1和PaOMT2。经序列比对发现,PaOMTs的N端均比来自其它植物的Ⅰ型OMT长约150个碱基。进化分析表明,PaOMTs都属于Ⅰ型OMT,但两个序列既不与经典的CCoAOMT聚成一簇,也不与CCoAOMT-like聚在一起,而是位于两个亚型之间,猜测两个OMT可能为Ⅰ型OMT的祖先。我们从植物中克隆了这两个基因,并将两个基因构建原核表达载体,IPTG诱导蛋白表达后用镍离子亲和层析的方法纯化蛋白,进行体外酶活功能鉴定。酶活结果显示PaOMT1和PaOMT2可催化一系列含有邻苯二酚结构的苯丙素类、香豆素类及黄酮类化合物,而对单个酚羟基均不具有催化活性：苯丙素类化合物(包含CCoA)生成间位甲基化产物；香豆素(秦皮乙素)可在间位或对位甲基化；黄酮的6-OH、3’-OH、4’-OH和5’-OH可被甲基化生成相应的甲醚或二甲醚。酶活结果显示PaOMT1和PaOMT2的最适底物分别是槲皮素和秦皮乙素。PaOMTs可催化生成不常见的对位甲基化产物,且两个序列具有高度的相似性,但最适底物类型不同,为了研究与底物选择性有关的结构域和关键氨基酸,对PaOMT2分别进行了点突变和结构域交换。发现N端和插入环会影响酶活但不能决定底物的选择性。PaOMT1和1PaOMT2的N端均比经典的CCoAOMT长约150 bp,分别将两个蛋白的N端截短并分别命名为PaOMT1-Tr和PaOMT2-Tr。体外酶活结果发现PaOMT1-Tr和PaOMT2-Tr的活性均略小于PaOMT1和PaOMT2,动力学结果表明截掉的N端序列对OMTs与底物的亲和性没有影响,但能提高蛋白对底物的转化速率。亚细胞定位结果表明截掉的N端序列不影响蛋白的表达位置。这是第一次从叶苔中鉴定出氧甲基转移酶基因,且第一次发现以秦皮乙素为最适底物的OMT。叶苔在植物界具有特殊的进化地位,钝鳞紫背苔中的CCoAOMT与其他植物有不同的序列及催化特征。为了进一步研究苔类植物中CCoAOMT的普遍催化特点和功能,本文分析了粗裂地钱(Marchantia paleacea)的转录组测序结果,筛选出三个注释为CCoAOMT的基因,并分别命名为MPaOMT1、MPaOMT2和MPaOMT3。进化分析表明,三个蛋白序列均位于Ⅰ型OMT的根部。分别分析三个OMT的序列及酶活特点发现,MPaOMT1与PaOMT1属于同源基因；MPaOMT2的序列与植物OMTs的差异很大,与哺乳动物的儿茶酚OMT有较高的相似性,最适底物是秦皮乙素；MPaOMT3序列与Ⅰ型OMT的长度相近,对咖啡醇和杨梅素均具有很高的转化率,相对其它苔类植物中的OMTs,对苯丙素类化合物的催化效率较高。MPaOMT3的N端含信号肽,可以引导序列定位于质体,但该段序列的存在会抑制酶活性。为了研究MPaOMTs的体内功能,分别构建了植物过表达载体,将目的基因转入拟南芥中,转基因株系还在进一步的筛选中；分析阳性转基因植物的木质素单体、苯丙素类和黄酮类化合物的变化,通过系统研究苔类植物OMTs的体内外功能,有助于分析植物OMTs起源和进化关系。