研究背景:氟元素对人体健康不可或缺,但摄入过量的氟可引起人体生理及病理的变化,从而对身体造成损害。地方性氟中毒是我国流行最为广泛、病情最为严重的地方病之一。氟主要侵犯骨组织,氟斑牙和氟骨症是地方性氟中毒的特征性损害。成年人体内99%的氟化物都存在于钙化组织(主要是骨骼)中,过量氟暴露引起的氟骨症与代谢性骨转换密切相关。研究者已经证明了氟骨症病变在不同条件下也会有活跃进展时期或相对静止时期;就其进展时期而言,无疑是处于高骨转换状态骨代谢的主要形式或骨重建循环,即破骨细胞通过分泌酸性物质溶解旧骨,从而发挥骨吸收功能;成骨细胞通过分泌、合成以及矿化骨基质来形成新骨,从而发挥骨形成功能。大量研究表明骨细胞直接参与骨形成和骨重建过程,其通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化成熟来影响骨重建过程。近年来,有关氟骨症的基础研究热点多在于氟化物对成骨、破骨的调控机制上,对骨细胞的研究相对较少,而氟化物对骨细胞如何调控成骨作用的研究更是少见。甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)是由甲状旁腺细胞所分泌的能够调控机体内钙稳态的一种活性多肽类激素。大量研究证实,PTH能够通过影响成骨细胞和骨细胞来参与骨转换过程。因此本实验利用骨组织的三种主要类型细胞进行染氟实验研究,旨在探究氟化物在骨细胞调控成骨机制中的作用,并进一步分析PTH在其中的地位,从而为进一步深入研究氟骨症的发病机制提供理论基础。实验方法:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验研究:我们选取骨组织的三种类型细胞,即成骨细胞选择其祖细胞(BMSCs)和前体细胞系(MC3T3-E1)、破骨细胞前体(RAW264.7)和骨细胞(IDG-SW3)作为实验对象,进行以下实验:(1)利用小鼠的股骨来分离成骨细胞祖细胞,经流式细胞仪鉴定其表面受体,得到确认其为BMSCs细胞;利用核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导破骨细胞前体7天后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色,确认其分化为TRACP阳性、多核的破骨细胞样细胞;利用矿化诱导液培养IDG-SW3细胞14~42天后,采用Western Blot法检测到SOST蛋白表达阳性,确认其骨细胞特征;利用矿化诱导液培养成骨前体细胞7~28天,使其分化为成熟的成骨细胞;(2)利用浓度为0.001~32 mg/L的氟离子处理成骨细胞、破骨细胞前体和骨细胞7天后,采用噻唑蓝(MTT)法检测骨组织中三种类型细胞的增殖活性。(3)利用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子联合其他条件处理三种细胞7天后,进行细胞的凋亡率分析。用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH(1-34)处理骨细胞7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)处理破骨细胞前体7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L PTH或相同氟浓度联合10 ng/mL TGF-β1处理成骨细胞祖细胞7天。各个实验结束后,采用美国BD公司的Annexin V-FITC凋亡试剂盒进行检测,观察骨组织三种细胞的凋亡情况。(4)利用明显影响细胞活性的,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理成骨细胞7天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,成骨细胞中Wnt10b、β连环蛋白(β-catenin)、Smad3、磷酸化Smad3、甲状旁腺素1受体(PTH1R)、核心结合因子2(Runx2)蛋白的表达变化;(5)利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10nmol/L的PTH处理骨细胞12天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,骨细胞中Smad3、磷酸化Smad3、硬化蛋白(SOST)、Dickkopf相关蛋白1(DKK1)、Wnt10b、β-catenin蛋白的表达变化。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验研究:利用孔径为3.0μm Polyester Membrance Transwell小室组成共培养系统,进行以下共培养实验:(1)将成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响破骨细胞活性,浓度为4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。采用实时定量PCR法,检测两种共培养系统中骨细胞所分泌的SOST、DKK1、RANKL、骨保护素(OPG)基因的表达变化。(2)将成骨细胞祖细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体(比例为2:1)混合培养在下层。利用明显影响成骨细胞活性,浓度为0.5 mg/L的氟离子处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h后。采用Diff-Quick Stain试剂盒进行染色,观察上层成骨细胞祖细胞增殖数量的变化。(3)将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体(比例为2:1)混合培养在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。上层成骨细胞通过碱性磷酸酶(ALP)染色检测其分化情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理7天后,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。(4)将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞28天。上层成骨细胞通过茜素红染色检测其矿化结节形成情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理28天,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。(5)将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h。采用实时定量PCR法,检测上层成骨细胞和下层骨细胞内相关基因的表达变化。实验结果:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验结果:(1)流式细胞仪鉴定成骨细胞祖细胞(BMSCs)表现为CD34/CD44双阳性信号,证明成骨细胞祖细胞具有成骨分化的潜能;破骨细胞前体(RAW264.7)经RANKL诱导7天后进行TRACP染色,破骨细胞前体表现为三核或多核的TRACP阳性细胞,表明其已诱导成为破骨细胞样细胞;IDG-SW3细胞经矿化培养液诱导14~42天,采用Western Blot法检测骨细胞标志物SOST蛋白的表达情况。实验结果表明,IDG-SW3细胞从21天开始表达骨细胞标志物硬化蛋白,直至42天仍表达硬化蛋白,证明其分化成为骨细胞。后续均选取矿化28天的IDG-SW3细胞进行实验研究。(2)细胞活性实验表明:氟对成骨细胞祖细胞作用范围窄,抑制作用较显著;破骨细胞前体对氟化物的作用比较敏感;成骨细胞活性整体呈现“倒U型”趋势,即随着氟浓度增加,成骨细胞活性逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降;与其他骨组织细胞类型比较,骨细胞对氟离子的耐受性较强。(3)细胞凋亡实验表明:高剂量的氟显著促进骨组织中三种主要类型细胞的凋亡,氟联合PTH显著促进骨细胞的凋亡,TGF-β1轻度提高了破骨细胞前体的凋亡率,但PTH和TGF-β1对成骨细胞祖细胞的促凋亡作用不明显。(4)染氟或染氟联合PTH处理成骨细胞7天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH不同程度的抑制了Wnt10b、β-catenin以及Runx2蛋白的表达,氟联合PTH处理与单独氟处理相比较,上面各因子的变化相类似。另外,染氟能够促进成骨细胞的Smad3蛋白的磷酸化。(5)染氟或染氟联合PTH处理骨细胞12天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH处理,不同程度的下调SOST蛋白的表达,而上调DKK1蛋白表达。低剂量氟可以不同程度的促进Wnt10b、β-catenin、Smad3和P-Smad3蛋白的表达。氟联合PTH作用与单独氟处理相比较,Wnt10b和β-catenin蛋白的变化相类似。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验结果:(1)成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞进行共培养,染氟或染氟联合PTH处理下层成骨细胞7天,基因表达水平分析的结果显示:成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显著下降,而DKK1基因的表达量正好与之相反,由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显著上升。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显著上升。而DKK1基因显著下降。另一方面,成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值在单独染氟或染氟联合PTH处理条件下均显著下降。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显著上升。(2)利用氟处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h,上层成骨细胞祖细胞的迪夫染色结果显示:Transwell小室上层的成骨细胞祖细胞的个数,在氟处理骨细胞与破骨细胞混合培养组最低。其余各阳性激活SOST组,包括染氟的骨细胞或骨细胞与破骨细胞前体混合培养组,成骨细胞祖细胞的细胞数量也呈下降趋势。(3)将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体混合培养在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天或28天,上层成骨细胞的碱性磷酸酶、茜素红染色结果显示:单独氟化物处理,刺激骨细胞诱导成骨细胞分化和成熟;而氟联合PTH处理,显著降低了成骨细胞的ALP活性,但刺激骨细胞诱导成骨细胞成熟。骨细胞与破骨细胞前体混合培养,单独染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞,上层成骨细胞分化趋势不明显。(4)将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天和28天,下层骨细胞在蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟处理7天和28天,均显著促进骨细胞中β-catenin蛋白表达的以及Smad3蛋白的磷酸化,均抑制了骨细胞标志物SOST蛋白的表达。单独染氟或染氟联合PTH处理7天,不同程度促进骨细胞内Wnt10b和DKK1蛋白的表达。对比之下,单独染氟或染氟联合PTH处理28天,对骨细胞DKK1蛋白的表达影响不大。单独染氟28天,骨细胞中Wnt10b蛋白的表达量下降,而染氟联合PTH作用进一步抑制了Wnt10b蛋白的表达。(5)染氟和染氟联合PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA技术降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h,基因表达水平分析的结果显示:Transwell小室下层骨细胞SOST表达干扰成功,表现为各处理组骨细胞的SOST基因水平明显下降。单独氟化物处理,以及氟联合PTH处理骨细胞内DKK1基因的表达量上升,也不同程度促进RANKL和OPG基因的表达。与空白对照组比较,Tranwell上层成骨细胞在单独染氟处理组成骨细胞的标志物Runx2基因成轻度下降趋势,而成骨细胞中Smad3和Wnt10b基因的表达量上升,并且β-catenin基因的表达增加较为显著。低剂量氟联合PTH处理骨细胞,成骨细胞内成骨标志物ALP和Runx2基因的表达量显著增加,同时成骨细胞中的Smad3、wnt10b基因的表达量也是升高的。结论:本研究表明氟虽然不能直接刺激成骨细胞内Wnt10b/β-catenin以及Runx2的蛋白表达,但可以介导骨细胞内SOST和Wnt10b蛋白来发挥作用。SOST在氟化物影响骨细胞调控成骨细胞分化方面扮演着重要角色,其中Smad3蛋白磷酸化、Wnt10b/β-catenin等因子参与了氟对骨细胞调控成骨细胞分化的机制。PTH不仅影响SOST,而且可以调节骨细胞内其他因子来发挥刺激成骨的作用。