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子宫颈癌是威胁妇女健康的第二大恶性肿瘤。近年来发病率不断上升,尤其是在发展中国家。每年大约有46万新发病例,大约27.4万患者死于子宫颈癌,且发病有年轻化趋势。子宫颈癌的发生是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的长期、连续的病理过程,目前流行病学和实验室研究数据均显示HPV感染是子宫颈癌的主要致病因素,尤其是高危型HPV感染与子宫颈癌高度相关。HPV16型是高危型人类乳头瘤病毒中最常见的类型之一,其早期蛋白E6及E7在宫颈鳞状上皮细胞恶性转化及恶性表型维持中均扮演着非常重要的角色。E6蛋白可与细胞内的E6相关蛋白(E6AP)形成E6/E6AP复合体,并与P53蛋白结合,E6AP将活化的泛素连接到P53蛋白,通过泛素介导的泛素途径使P53蛋白降解；E7与生长抑制蛋白pRB结合,使pRB蛋白磷酸化,释放转录因子E2F,使感染细胞得以实现基因转录、增殖。抑癌基因P53、pRB的下调,可激活端粒酶,阻断干扰素的产生,增加外源DNA的整合及突变,抵抗细胞凋亡,最终导致癌变。RNA干扰(RNA interference,RANi)技术是近年来新发展的一项以一个特异的mRNA降解为目标的基因沉默技术,RNAi不仅具有更高的基因特异性,而且抑制效率及抑制稳定性均比核酶或反义核酸要高。我们采用RNAi技术沉默宫颈癌Siha细胞株中HPV16 E6基因的表达,以观察HPV16 E6沉默后对宫颈癌Siha细胞的生长及细胞凋亡的影响,为探索高危型人类乳头瘤病毒导致宫颈癌发生的机制研究提供新的理论依据,以期为宫颈癌的基因治疗寻找新的思路。
目的:
利用RNA干扰(RNAi)技术,使用基因特异性的靶向于HPV16 E6基因的小干扰RNA(SiRNA)作用于HPV16 E6阳性的宫颈癌细胞株SiHa,沉默宫颈癌Siha细胞的HPV16 E6基因,通过检测干扰组与未干扰组之间HPV16 E6 mRNA及蛋白的变化、抑癌蛋白P53的变化,以及各组之间Siha细胞凋亡率的改变,探讨HPV16 E6 SiRNA对HPV16阳性SiHa细胞E6基因的特异性抑制作用,以及对细胞凋亡的影响,为探索高危型人类乳头瘤病毒导致宫颈癌发生的机制研究提供新的理论依据,为使用RNAi技术治疗宫颈癌的可行性提供实验基础。
方法:
(1)SiRNA序列的构建:根据SiRNA的设计原则和GenBank中HPV16 E6cDNA序列,应用Ambion公司的在线设计软件,分别在其序列不同位点针对HPV16 E6设计两对DNA片段,并分别连接至pSilencerTM 3.1-H1 hygro,构建两对小干扰RNA:SiRNA-109(S Ⅰ)及SiRNA-142(S Ⅱ),以及通用阴性对照NC(NegativeControl)和阳性对照SiRNA:GAPDH(Human GAPDH)SiRNA,均带荧光标记绿色荧光蛋白(FAM)。测序结果显示构建的两对SiRNA序列与设计的DNA序列完全一致。由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。
(2)细胞培养与转染:SiHa细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养,培养条件为37℃、5％CO2。于转染前24d'时铺至6孔板,培养至细胞30-50％融合时使用LipofectamineTM2000脂质体转染。实验分5个组:空白对照组(未转染组)、脂质体组(LIPO对照组)、阴性对照SiRNA转染组(NC转染组)、SiRNA-109转染组(SⅠ转染组)、SiRNA-142转染组(S Ⅱ转染组)。以脂质体6μl:SiRNA100pmol比例进行转染,按照转染试剂盒说明书操作,于OPTI MEMI中培养6小时后换完全培养基。
(3)RT-PCR检测HPV16 E6基因表达:以GAPDH做为内参,由上海生工生物技术服务公司合成引物,参照TAKARA逆转录试剂盒要求的条件进行反转录。PCR反应条件:预变性94℃ 3min,94℃ 30s,58℃ 45s,72℃ 45s,32个循环,72℃1min。取反应产物行琼脂糖凝胶电泳,观察目的条带、摄片并应用灰度分析软件分析。
(4)Western Blot检测蛋白表达:于转染后48h收获各组细胞各约1×106个,蛋白裂解液裂解蛋白,变性,10％SDS-PAGE电泳,湿法转印PVDF膜,TBST漂洗后,5％脱脂奶粉封闭,分别与P53、HPV16 E6及GAPDH一抗、二抗孵育,ECL显色,应用灰度分析软件分析。
(5)流式细胞仪检测细胞凋亡:于转染后48 h,各组细胞分别消化、离心收集。PBS洗涤细胞后,加入annexin V孵育30min,加PI至终浓度为50mg/L,用流式细胞仪检测。
(6)统计学分析:采用SPSS13.0软件统计分析,服从正态分布的计量资料采用均数±标准差((x)±s)表示,采用one-way ANOVA方差分析,组间多重比较采用LSD法分析,以P<0.05认为差异有统计学意义。
结果:
(1)转染后Siha细胞内HPV16 E6 mRNA的表达变化:RT-PCR结果显示,未转染组、LIPO对照组、NC转染组、S Ⅰ转染组及S Ⅱ转染组HPV16 E6mRNA表达水平分别为0.711±0.023、0.729±0.071、0.741±0.042、0.109±0.028及0.126±0.007,各组间差异有统计学意义(F=202.864,P=0.000)。转染后24h,SⅠ及S Ⅱ转染组Siha细胞内HPV16 E6 mRNA表达水平比未转染组分别减少了84.7％和82.3％,减少有统计学意义(分别为P=0.000,P=0.000)。
(2)转染后Siha细胞HPV16 E6及P53蛋白表达水平的变化:Western Blot结果显示,未转染组、LIPO对照组、NC转染组、S Ⅰ转染组及S Ⅱ转染组HPV16 E6蛋白表达水平分别为1.734±0.013、1.587±0.122、1.753±0.077、0.668±0.074及0.646±0.018,各组间差异有统计学意义(F=182.275,P=0.000)；未转染组、LIPO对照组、NC转染组、S Ⅰ转染组及S Ⅱ转染组P53蛋白表达表达水平分别为0.428±0.030、0.524±0.034、0.4954±0.037、1.477±0.112及1.5964±0.082,各组间差异有统计学意义(F=223.037,P=0.000)。同样,Western blot检测结果亦显示,S Ⅰ转染组及SⅡ转染组HPV16 E6蛋白抑制率分别为61.5％及62.7％,减少均有统计学意义(分别为P=0.000,P=0.000)；S Ⅰ转染组及S Ⅱ转染组P53蛋白表达水平分别较未转染组升高245％及273％,增加均有统计学意义(分别为P=0.000,P=0.000)。
(3)转染后Siha细胞凋亡的变化:转染后48小时,流式细胞学分别检测未转染组、LIPO对照组、NC转染组、S Ⅰ转染组及SⅡ转染组凋亡率。结果显示:未转染组凋亡率为6.700±0.243；LIPO对照组凋亡率为6.273±0.780；NC转染组凋亡率为5.963±1.212；S Ⅰ转染组凋亡率为34.387±3.140；SⅡ转染组凋亡率为11.243±1.876。各组间细胞凋亡率的差异有统计学意义(F=143.806,P=0.000)。组间比较,S Ⅰ转染组与未转染组相比细胞凋亡率显著增加,增加有统计学意义(P=0.000)；SⅡ转染与未转染组相比细胞凋亡率显著增加,增加亦有统计学意义(P=0.010)；S Ⅰ转染组与S Ⅱ转染组细胞凋亡率的差异亦有统计学意义(P=0.000)。
结论:
通过利用SiRNA介导的基因干扰的手段可以有效下调宫颈癌Siha细胞中HPV16 E6的表达,使抑癌蛋白P53表达上调,细胞凋亡增加,进而在一定程度上扭转肿瘤细胞的恶性进程,抑制宫颈癌细胞的恶性增殖,这为证明高危型人类乳头瘤病毒是宫颈癌发生的因为提供了有力佐证,同时也为宫颈癌的基因治疗开辟了新的思路。