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灵芝,多孔菌科真菌赤芝,是一种珍贵的药食两用菌,是中药(TCM)宝库中的珍品。MicroRNA(miRNA)是一类18-26个核苷酸(nt)长度的非蛋白质编码的内源小分子RNA,在基因表达中起着重要的负调节作用。据研究报道,灵芝内含有许多生物活性成分,包括多糖、生物碱、蛋白质、灵芝酸、甾醇、氨基酸、三萜类和微量元素等,并且这些成分的研究已经非常清楚,但尚无小分子RNA,特别是microRNA的相关报道。本文旨在对灵芝microRNA开展初步研究,通过对其microRNA进行分离与鉴定,为灵芝microRNA在医药领域中作用机制的研究打下基础,为灵芝在药食用价值上的研究探索新的思路。本研究采集了新鲜的灵芝子实体及灵芝孢子粉,分别采用传统方法和Direct-zolTM RNA MiniprEP试剂盒法对新鲜灵芝子实体和灵芝孢子粉进行总RNA的提取,其后对总RNA进行浓度、纯度检测以选择出更好的材料和更优的方法去开展灵芝RNA的研究;应用Illumina测序平台对灵芝进行小分子RNA高通量测序,结合生物信息学的方法对其进行深度的分析,同时预测新的待选miRNA(PC miRNA);挑选了7个microRNA(4个已知的microRNA,3个新的microRNA),采用荧光定量PCR和Northern Blotting方法对其进行鉴定验证。主要研究结果如下:(1)分别采用传统方法和Direct-zolTM RNA MiniprEP试剂盒方法对灵芝子实体和灵芝孢子粉进行总RNA提取,总RNA浓度和纯度分别为:传统灵芝子实体—2510ng/μL,OD260/280 1.84;Direct-zolTM RNA MiniprEP试剂盒法提取灵芝子实体—2054ng/μL,OD260/280 2.00;传统灵芝孢子粉—420ng/μL,OD260/2801.85;Direct-zolTM RNA MiniprEP试剂盒法提取灵芝孢子粉—270ng/μL,OD260/280 1.99。结合电泳图得出对于灵芝RNA的研究,选择灵芝子实体为材料,选择Direct-zolTM RNA MiniprEP试剂盒法为提取方法。(2)利用Illumina高通量测序技术构建了灵芝小RNA文库,共获得小RNA文库高质量序列10,127,291条。去接头、去污染后在灵芝小RNA文库中得到9,071,523(774,547 unique)条clean reads。对小RNA文库中的clean reads进行长度分布统计分析,截取了有效长度区间序列(18-50 nt),其中小RNA read数在30 nt(piRNA)、43 nt和50 nt处有较高的峰值,18-26 nt(主要是microRNA)小RNA序列占总小RNA(18-50 nt)50%左右,其中20 nt的序列最多。(3)使用软件miREvo对clean Reads进行分析,共检测到已知的miRNA 132个,预测novel miRNA 34个,新的miRNA的前体均能形成特征性发卡结构;和Rfam数据库进行比较,比对上ncRNA 10436条。使用NCBI和miRBase数据库及mage软件对已知的mi RNA进行了简单的进化分析。(4)分别利用qRT-PCR和Northern blotting方法对挑选的7个miRNA(4个已知的miRNA和3个新的miRNA)进行表达量分析以验证高通量测序结果,分析发现,qRT-PCR中7个miRNA中有6个序列(glu-miR9386,glu-mi R-125,glu-miR-99,glu-miR-99-1,PC miRNA 1,PC miRNA 3)均有较高的表达量,Northern blotting中有5个miRNA具有高表达量(glu-miR9386,glu-miR-125,glu-miR-99,glu-miR-99-1,PC mi RNA 2,PC miRNA 3)。本研究通过对灵芝小RNA的分离与鉴定分析及灵芝子实体microRNA的表达量分析发现:灵芝内存在数量众多的小RNA,这预示着灵芝中可能存在复杂的转录后基因表达调控机制;本研究首次开展了真菌灵芝的小RNA鉴定,增加了基因库中新的小RNA和microRNA种类,也为后续对灵芝小RNA,特别是microRNA在医学和药学领域中的作用机制研究打下基础。