研究背景尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGTs),是一类重要的II相结合酶,可以催化很多种化合物(包括药物及环境有毒物质)发生葡萄糖醛酸化结合反应。研究表明,约35%的药物通过UGTs代谢。UGTs主要由UGT1A、UGT2A和UGT2B3个亚家族构成。UGT1A1是其中唯一参与胆红素代谢的酶,此酶活性的完全或部分缺失导致胆红素不能与葡萄糖醛酸结合形成结合胆红素,使非结合胆红素在体内堆积,导致Crigler-Najjar综合征(包括I型、II型)和Gilbert综合征。新生儿高胆红素血症即新生儿黄疸,是新生儿期最常见的症状,发病率约60-80%。研究显示,新生儿黄疸原因除了与母乳喂养、低体重、脱水、早产及UGT1A1基因多态性等有关外,更主要的是与肝脏UGT1A1发育不完善、酶活性缺失有关。这提示进行UGT1A1发育调控的研究是控制新生儿血胆红素在正常水平的关键环节。已有研究表明,UGT1A1活性随个体的成长发生较大的变化,从胎儿到成人并非呈线性发育。因此,UGT1A1表达水平及酶活性的不同导致了成人和儿童在药物代谢及疗效上的差异,会对儿科临床用药产生直接的影响。婴幼儿特别是新生儿由于代谢酶发育不成熟,容易发生药物不良反应。因此对于儿童人群,除遗传因素外,发育对药物代谢酶的影响可能起着关键作用。尽管大多数药物在肝脏进行代谢,但多数肝脏药物代谢酶的发育模式还不清楚。因此,本研究将揭示肝脏Ⅱ相结合酶UGT1A1的发育变化规律,这对于儿童临床合理用药具有重要的指导意义。转录因子,即反式作用因子,通过识别结合各类顺式作用元件来调控靶基因转录效率的一类蛋白质。肝脏内一些转录因子特异性地调控参与内源性及外源性化合物代谢相关基因的表达,如CYPs(cytochrome P450)、UGTs等基因。与I相酶相比,II相酶较少受到研究者关注。因此,这些转录因子是否参与调控肝脏发育过程中UGT1A1基因的表达仍有待进一步研究。近年来研究表明,表观遗传修饰在个体发育过程中对基因转录调控发挥着至关重要的作用。组蛋白甲基化是一种重要的组蛋白修饰,指在组蛋白甲基转移酶催化下组蛋白H3和H4的N端赖氨酸或者精氨酸残基发生了甲基化。研究证实组蛋白修饰激活性标志H3K4me2促进基因活化,而抑制性标志H3K27me3则沉默基因表达。Li等报道H3K4me2和H3K27me3共同参与了胎鼠及成年鼠Cyp3a基因的发育表达调控。但就肝脏UGT1A1的发育表达调控而言,有关表观遗传修饰机制方面的研究目前还未见报道。综上所述,表观遗传修饰参与UGT1A1表达调控的机制研究尚处于起步阶段,本研究将探讨人肝脏发育过程中UGT1A1的动态变化以及组蛋白修饰参与UGT1A1基因发育调控的机制。表观遗传调控是引起药物代谢及转运个体差异的重要原因,深入研究药物代谢酶的表观修饰调控机制,将有助于临床药物的合理应用及减少不良反应,为儿童患者发展个体化治疗策略提供新的理论依据。第一部分转录因子参与调控人肝脏发育过程中UGT1A1的动态表达目的UGT1A1是肝脏中参与胆红素葡萄糖醛酸化反应唯一的II相酶,此酶活性的完全或部分缺失可以导致非结合型高胆红素血症。本部分研究UGT1A1及相关转录因子在人肝脏发育过程中的动态表达,并分析它们之间是否存在相关性,探讨转录因子发育表达对UGT1A1的动态表达的影响。方法1.收集90例中国汉族人群肝脏标本,其中成人肝脏样本41例(34-72岁),儿童肝脏样本8例(3个月-2岁)和胎儿期肝脏样本41例(18-38孕周)。2.采用qRT-PCR方法检测肝脏标本中UGT1A1及PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等转录因子的m RNA表达情况,分析UGT1A1表达水平与转录因子表达水平之间的相关性。3.采用western blot法及HPLC法检测肝脏标本中UGT1A1的蛋白表达水平及体外酶活性。4.采用直接测序法检测UGT1A1*6(211G?A)及UGT1A1*28(TA6?TA7)遗传多态性。结果1.人肝脏发育过程中UGT1A1 m RNA、蛋白水平及酶活性的动态表达。UGT1A1表达在胎儿期很低,在儿童期和成人期显著增高。与胎儿期相比,儿童期和成人期UGT1A1的m RNA、蛋白及酶活性分别增高了120倍、20倍和10倍。2.人肝脏发育过程中转录因子的表达水平及其与UGT1A1的相关性。转录因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等表达水平在人肝脏的各发育阶段与UGT1A1表达水平一致,呈现动态表达。与胎儿组相比,儿童组和成人组转录因子表达水平显著增高。转录因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A及PPARA等表达水平与UGT1A1的m RNA及蛋白表达水平均呈正性相关。3.基因多态性对UGT1A1表达的影响。UGT1A1*6和UGT1A1*28使UGT1A1的m RNA、蛋白表达水平及酶活性降低了约40-60%。第二部分组蛋白修饰参与调控人肝脏发育过程中UGT1A1的动态表达目的组蛋白甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰,组蛋白修饰激活性标志物H3K4me2促进所在基因的活化,而抑制性标志物H3K27me3则抑制基因的表达。研究在人肝脏发育过程中胎儿期及成人期UGT1A1基因中组蛋白修饰富集峰的差异,初步探讨组蛋白修饰对UGT1A1的动态表达的影响。方法1.随机选取4例肝脏样本(包含胎儿期及成人期各2例),选用特异性抗体H3K4me2和H3K27m3,进行染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验。2.将得到的富集DNA送深圳华大公司进行文库构建、高通量测序,并进行生物信息学分析。3.进行胎儿和成人肝脏H3K4me2及H3K27m3组蛋白修饰的全基因组图谱分析。4.随机选取3例胎儿肝脏样本和3例成人肝脏样本,用设计的引物分别进行Ch IP-q PCR检测,验证Ch IP-seq实验结果。结果1.H3K4me2在胎儿及成人肝脏富集峰差异分布。H3K4me2在成人肝脏UGT1A1基因的启动子区附近有一个长度为5873 bp的富集峰;H3K4me2在转录因子HNF1A、HNF4A、GR、PXR、PPARA、CAR和RXRA等基因有一个或多个富集峰。2.H3K27me3在胎儿及成人肝脏富集峰差异分布。H3K27me3在胎儿肝脏UGT1A1基因的启动子区上游12 kb附近有一个长度为226 bp的富集峰;H3K27me3在转录因子GR、CAR、RXRA、HNF4A等基因有一个或多个富集峰。3.Ch IP-q PCR验证Ch IP-seq结果的可靠性。与胎儿肝脏相比,H3K4me2在成人肝脏的平均富集倍数是3.2;而与成人相比,H3K27me3在胎儿肝脏的平均富集倍数是3.7,可见Ch IP-q PCR与Ch IP-seq结果一致,证实了Ch IP-seq实验结果的可靠性。第三部分组蛋白修饰调控人肝脏发育过程中UGT1A1动态表达的分子机制目的第二部分研究发现组蛋白修饰H3K4me2及H3K27me3参与了肝脏UGT1A1动态发育的表达调控,但组蛋白修饰参与UGT1A1基因的发育调控的分子机制不清,该部分拟用si RNA、Ch IP-seq及Co-IP等方法探讨转录因子是否募集组蛋白修饰酶等调控UGT1A1的基因表达。方法1.借助转染si RNA下调HNF1A表达,转染后继续培养细胞24 h-48 h,收集细胞进行qRT-PCR、Co-IP或ChIP分析。2.收集转染si RNA后的细胞,使用H3K4me2、H3 Acetylation、HNF1A及NCOA6抗体,进行染色质免疫共沉淀处理,收集富集的DNA片段,进行q RT-PCR分析,探讨转染si RNA下调HNF1A表达前后在UGT1A1基因启动子区的组蛋白修饰H3K4me2及H3 Acetylation、核受体辅调节因子NCOA6及转录因子HNF1A的富集变化。3.进行Co-IP检测,探讨转录因子HNF1A与组蛋白甲基化酶MLL1、以及HNF1A与核受体辅调节因子NCOA6是否存在相互作用。4.检测组蛋白甲基转移酶EZH2表达水平及UGT1A1表达水平,并进行二者相关性分析。结果1.si HNF1A干扰后检测转染细胞内HNF1A及UGT1A1基因的表达。在Hep G2及LS174T两个细胞系中,转染si HNF1A组与阴性对照相比,HNF1A及UGT1A1蛋白表达水平下降了约70-80%。2.si HNF1A干扰对UGT1A1基因启动子区组蛋白修饰等的影响。在HepG2及LS174T两种细胞系中,si HNF1A组与阴性对照组相比,在UGT1A1基因启动子区的HNF1A结合位点附近(-181~-1)的H3K4me2及H3 Acetylation、HNF1A及NCOA6的富集均明显下降。3.转录因子HNF1A与组蛋白修饰酶及核受体辅调节因子的相互作用。Co-IP实验证实,在LS174T细胞及Hep G2细胞中,MLL1与HNF1A存在相互作用;NCOA6与HNF1A存在相互作用。4.组蛋白甲基转移酶EZH2蛋白表达水平与UGT1A1 m RNA及蛋白表达水平均呈负相关。结论1.转录因子的发育表达参与调控人肝脏发育过程中UGT1A1的动态表达;2.表观遗传修饰H3K4me2、H3K27me3参与调控人肝脏发育过程中UGT1A1的动态表达;3.转录因子HNF1A通过募集组蛋白修饰酶、核受体辅调节因子等激活UGT1A1的转录表达;组蛋白甲基化酶EZH2可能参与调控UGT1A1的动态表达。