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细胞色素P450单加氧酶系是广泛分布于生物有机体中的重要酶系,一直是生物学领域研究的一个重要对象。细胞色素P450在具有还原性辅酶Ⅱ和分子氧的情况下,能够与底物结合并进行电子传递。至今,已发现的昆虫P450的功能主要有两大类:一是催化内源性物质（如甾醇、脂肪酸及信息激素等）的生物合成和降解,维持生物体的正常功能;二是针对外源性物质（如杀虫剂、植物次生物质及诱变剂前体等）起到解毒与活化的作用。其中细胞色素P450对杀虫剂的代谢作用增强是大多数昆虫产生抗药性的主要机制。赤拟谷盗Tribolium castaneum（Herbst）是在世界范围内广泛分布且具有重要经济意义的害虫,主要危害谷物及储藏物。其危害方式为直接取食、加速谷物霉变、粪便污染等。早在1972～1973年的全球调查中就发现其对多种药剂尤其是PH3产生了严重的抗性。近年来,随着国际贸易的日趋频繁,赤拟谷盗的发生范围越来越广、危害越来越重,其抗性问题日益受到重视。此外,赤拟谷盗还是一种重要的模式昆虫,以模式昆虫为代表,解明其基因功能,有助于从害虫自身出发,研究害虫防治的新理论和新技术。本学位论文在国家自然科学基金的资助下,以赤拟谷盗为研究对象,对赤拟谷盗P450的基因进行克隆研究。从赤拟谷盗敏感品系中克隆获得一个新的细胞色素P450 cDNA全长序列,经国际细胞色素研究委员会命名为CYP345D3,GenBank的登陆号为EU008544。该核苷酸序列全长为1554bp,开放阅读框的范围是从第32个碱基到第1513个碱基,编码了493个氨基酸,分子量57466kD。推导的氨基酸序列中含有最为经典的血红素结合基序FXXGXXXCXG（残基:430-439）以及其它所有P450的特征基序。序列比对表明,该序列与赤拟谷盗的P450基因CYP345D1（Tribolium castaneum,XP966774）序列相似性最高,达到91%,其次为赤拟谷盗的CYP345D2（Tribolium castaneum,XP969536）,达62%;东亚飞蝗CYP6H1（Locustamigratoria,AF115777）和黑腹果蝇CYP6G1（Drosophila melanogaster,NM136899）为36%;家蝇CYP6A1（Musca domestica,M25367）和尖音库蚊CYP6F1（Culex pipiens pallens,AY662654）为34%;尖音库蚊CYP6E1（Culex pipiens quinquefasciatus,AB001323）、家蝇CYP6C1（Muscadomestica,U09233）、CYP6D1（U15168）和黑尾凤蝶CYP6B1（Papilio polyxenes,Z29624）为33%。而与赤拟谷盗CYP346A1（Tribolium castaneum,XP967901）同源性为32%;褐家鼠CYP3A1（Rattus norvegicus,NM173144）为31%;褐家鼠CYP4A1（Rattus norvegicus,M57718）为25%;家鼠CYP1A1（Mus musculus,NM009992）和赤拟谷盗CYP315A1（Triboliumcastaneum,XP970122）为24%。系统发育分析结果表明其他昆虫的CYP6家族的P450基因与CYP345D3的亲缘关系比哺乳动物其它家族的P450基因更近,这也证实了序列比对的结果。以已知的人类肝脏的P450基因CYP3A4的蛋白晶体结构为模板,对得到的赤拟谷盗P450基因进行同源建模,得到了赤拟谷盗P450的模拟三维结构模型,并比对人类肝脏的活性中心,找到了赤拟谷盗P450的酶解活性中心半胱氨酸Cys437。本研究试图克隆其他赤拟谷盗细胞色素P450家族的基因全序列:利用cDNA末端快速扩增（3’RACE）技术,以简并引物扩增出的243bp序列信息为基础,设计上游特异性引物GSP和下游通用引物AP进行半套式扩增,获得2个3’RACE序列。然后以同样方法扩增5’RACE序列未获得成功。进而分析了5’RACE失败的原因,并提出相应的改进措施:（1）保证RNA的完整性;（2）在内部再设计一条特异性引物进行巢式PCR;（3）提高二次扩增的退火温度。优化扩增条件等。对赤拟谷盗P450 cDNA基因进行克隆和序列分析,为研究P450在赤拟谷盗抗药性形成及发展中的作用如过量表达、氨基酸替换等奠定了基础,充实了生物进化及遗传变异的研究内容。同时针对发生改变的分子结构设计特定的靶标杀虫剂,为农药研究和害虫综合防治提供一定的理论依据。