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一、研究目的:以B16F10及其相应肺转移的移植瘤作为研究对象,应用2D-DIGE的方法联合质谱技术鉴定黑色素瘤转移相关的蛋白,并验证部分蛋白的功能,以期为临床上找到预测黑色素瘤血道转移的标志物提供理论依据。二、研究内容:1.第一部分的研究内容主要是在小鼠B16F10的皮下移植瘤传代过程中,发现若干小鼠出现自发性肺转移,我们将具有黑色素瘤转移的肺脏进一步移植至小鼠的鼠蹊部,并进行传代,获得了稳定传代的肺转移移植瘤(B16M组),并比较了肺转移移植瘤与B16F10移植瘤(B16组)之间的特性差异。2.第二部分的研究内容主要是应用差示凝胶电泳技术比较了B16组和B16M组之间的差异蛋白表达,应用质谱技术鉴定了相关蛋白。3.第三部分的研究内容主要是利用western blotting的方法验证vimentin的质谱结果,并在70例有完整预后的恶性黑色素瘤临床标本上探究其临床意义。三、研究方法:1.第一部分:50只C57BL/6J小鼠,雌雄各半分成两组,其中25只C57BL/6J小鼠的鼠蹊部接种B16F10单细胞悬液(B16组),另外25只接种肺转移移植瘤的单细胞悬液(B16M组),待肿瘤直径约为1cm左右时处死小鼠,分离收集肿瘤组织,进行H&E染色。观察H&E切片,计数2组的血管生成拟态密度(VMD)及微血管密度(MVD),进行MMP-2及MMP-9的免疫组织化学染色。2.第二部分:分别提取8例B16组及8例B16M组冻存肿瘤组织的蛋白,将每组8例的蛋白提取物混合在一起,进行差示凝胶电泳。在同一块胶上分别应用Cy3、Cy5标记各组样本及Cy2标记2组的混合样本作为内参,在第二块胶上进行反向标记,Cy2, Cy3, Cy5的激发波长分别是488/520nm,532/580nm和633/670nm, DeCyder软件进行胶内和胶与胶之间的差异分析,获得的差异表达的蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析,获得肽质量指纹图的数据,利用MASCOT Peptide Mass Fingerprint查询软件搜索并鉴定差异蛋白质。3.第三部分:应用western blotting的方法在上述提取的每组8例的蛋白标本中验证质谱结果,并收集随访完整的临床病例资料,进行免疫组织化学染色来进一步探究差异蛋白的临床意义。四、研究结果1.B16M组与B16组的特性差异B16M组的肿瘤组织外观颜色变浅,呈灰白色或灰黄色,质地呈鱼肉样,B16组的肿瘤组织呈典型的黑色,质地较软。通过H&E染色的观察和MMP-2、MMP-9的免疫组织化学染色,发现B16M中存在血管生成拟态(VM),且VMD较B16组显著增高,MMP-2、MMP-9的阳性表达率也高于后者,且B16M组有明显色素缺失的特征,类似于临床上的无色素黑色素瘤的表现,说明B16M具有高转移高侵袭力的特质。2.B16M组与B16组的差示凝胶电泳和质谱结果选择2D-DIGE来替代传统的2-DE筛选转移组与原发组的差异表达蛋白,并应用MALDI-TOF/TOF MS来鉴定差异蛋白点,共获得13个转移相关蛋白,其中11个在B16M组中上调,2个为下调,上调的蛋白有:vimentin、PGK1、enolase 1、TPI、Bip、laminin binding protein、GAPDH、myoglobin、proteasome activator reg alpha、β-actin和γ-actin,下调的为2个未命名蛋白。所示蛋白其功能涉及细胞骨架、糖代谢、分子伴侣和免疫调节等多方面。3. vimentin的质谱结果验证和临床意义应用Western Blotting方法验证了质谱中vimentin的鉴定结果,并在70例临床随访完整的标本中应用免疫组化检测vimentin的表达,vimentin的阳性表达为肿瘤细胞胞浆染成黄色,阳性细胞数>40%为高表达组,<=40%为低表达组。采用卡方检验检测vimentin的高/低表达与患者各临床病理资料之间的关系,可见vimentin的高表达与血道转移有密切的联系,而与年龄、性别、发病部位、TNM分期和淋巴结转移之间无明显的联系,P值均大于0.05。五、研究结论Vimentin与黑色素瘤的转移密切相关,高表达的vimentin对于原发黑色素瘤来说,是血道转移的预测因素之一。在临床上,Vimentin不仅仅是确诊黑色素瘤的标志物,还是指导临床预后的预测因素之一,有望成为今后预测黑色素瘤血道转移的标志物和治疗的靶点。