对受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究，有利于揭示细胞周期的调控机制，对生长、发育、癌变、死亡有进一步认识。小鼠受精卵是脊椎动物中与人类种属较为接近的细胞周期模型，但由于取材有限，关于小鼠受精卵早期发育机制的研究，尤其是1细胞期向2细胞期转换，即G2/M期转换机制的研究进展缓慢，因此也成为国际上研究的热点之一． Plks激酶(Plks)是广泛存在于真核生物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，Plks家族成员较多。在Plks家族中果蝇polo基因是最早被发现的。后来又发现了酿酒酵母(saceharmyces cervisiae)中的cdc5p激酶，芽殖酵母(shizosacchermyces pombe)中的polol激酶，爪蟾(Xenopus)中的Plx1，高等脊椎动物的Plk1，小鼠中的Snk和Fnk，以及人细胞中的hSnk和prk等。 在有丝分裂过程中的不同的几个时期都需要Plks的作用，Plks的活性随时间的变化可以支持这一观点。在哺乳动物细胞Plkl的活性在G2/M转换期迅速增高，几乎与CDK1的活性同时增高。但其活性在CDK1的活性下降后仍保持较高水平。小鼠卵中生发泡破裂(GVBD)前30分钟，Plk1的活性开始升高，在GVBD时达到最高，此后Plk1的活性略有下降，但是在卵的整个成熟过程中仍能保持较高的活性。乙醇活化发生孤雌生殖后Plk1被去磷酸化活性逐渐降低。在进入第一次有丝分裂的M期中的核膜破裂期，Plk1被磷酸化活性有升高。总之，Plks的时空分布、蛋白量及活性变化与其功能密不可分。 在G2/M转换期，Plk据记载定位于SPB周围，而此时MPF复合体也出现在同一位置，并发现在MPF活化时Plks活性升高，因而推测Plks可能参与了MPF在G2/M转换期的激活过程。在爪蟾Plx1被抗体中和后cdc25和MPF活性受到抑制，假如有活性的cdc25可以逆转此趋势，说明Plx1可能参与了cdc25的激活，进而激活MPF。又发现Plx1的激活略晚于MPF，其活性可被CDK的特异性抑制剂完全抑制，可以推测Plx1的激活也依赖MPF的活性。 由此推断MPF可通过激活Plx1间接活化cdc25然后激活更多的MPF，是一个自我催化活化环，并且Plx1参与其中。同时还有研究表明在爪蟾中当Plx1失活时，MPF的抑制性激酶Myt1可被激活而发生超磷酸化，从而抑制cdc2的活化。可以看出Plx1在G2/M转换期既活化了MPF的激活物cdc25又抑制了MPF的抑制物Myt1从而推动了MPF的激活，是细胞分裂进入M期。除了上述的推断外有实验证明Plx1对cdc25的激活作用。Qian(1998)用突变技术将Plx1的Ser125、Thr201残基换为带负电的Asp残基(S128D/T201D)得到有极高Plx1活性的突变体，并将其mRNA注入爪蟾卵中，可直接激活cdc25和MPF。此外Roshak(2000)研究也发现无论免疫共沉淀得到的Plks蛋白还是重组得到的均可直接磷酸化人的cdc25c。 近年来，关于Plk1信号转导途径的报道日益增多，但是有关Plk1在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用的报道仍然很少。我们前一部分工作对小鼠1-细胞期受精卵中Plk1的表达及其活性进行了初步观察，发现Plk1的表达和活性在小鼠受精卵早期发育的过程中有变化，因此可能参与G2/M期的转换过程，为了作进一步的研究，通过使用Plk1 shRNA和Plk1的特异性抑制剂scytomenin来抑制Plk1的生物学功能，观察Plk1对于受精卵早期发育的作用，及其的作用途径。 类帕霉素是从土壤吸湿链球菌中分离出来的一种抗生素，结构与大环内酯类抗生素FK506类似，类帕霉素进入体内后与其受体FKBP12结合，然后与另外一种大分子蛋白结合，形成三联复合体，这种大分子蛋白被称为类帕霉素靶(TOR)。TOR首次从酵母中发现，随后在哺乳动物中也发现了TOR的同源蛋白mTOR。mTOR(mammalian target of rapamycin)蛋白是一结构与功能保守的蛋白质，是磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族成员，具有丝/苏氨酸激酶活性，是调节细胞生长的中心调控因子。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与细胞内一系列生理病理过程，其存在形式主要有两种：mTOR/Raptor复合物和mTOR/Rictor复合物。mTOR/Raptor复合物的发现早于mTOR/Rictor复合物，作用主要是通过调节蛋白质的合成影响细胞生长和增殖，其活性能够被雷帕霉素抑制。mTOR/Rictor复合物的活性不能被雷帕霉素抑制，主要参与细胞骨架蛋白的构造，具体功能仍在进一步研究之中。 众所周知，PKB是调节细胞增殖的重要因子。有报道显示，PKB可以直接磷酸化GSK-3并使其失活，从而促进cyclin D1的核定位，最终激活Cdk4/eyclin D1复合体，推动G1期进程。另一方面，PKB可以将Cdk的抑制因子p21Waf1/Cip1和p27Kip1磷酸化，导致它们定位于细胞浆，并抑制它们的生理功能。这些结果说明PKB通过激活正性调节因子和失活负性调节因子同时促进G1期进程，完成G1/S期转换。同时，PKB还可以有效的调节M期进程。在Rat-1细胞中使用LY294002抑制P13K的活性以后可以引起G2/M期阻滞；当过表达持续激活型PKB或缺失PTEN时，细胞能克服由于γ射线照射引起的G2/M期阻滞。因此，PKB能有效的促进哺乳动物细胞周期中G2/M期转换。我们实验室的前期工作显示，PKB特别是持续激活型PKB，通过影响Cdc2-Tyr15的磷酸化状态促进MPF的活化，参与了受精卵早期发育到2-细胞期的调节过程。 但在小鼠受精卵中，关于mTOR/rictor的作用机制和其信号通路还未见报道。本实验通过观察小鼠1细胞期受精卵中mTOR和PKB的各期活性变化来分析它们之间活性变化的关系，应用Scansite分析软件对小鼠PKB蛋白序列进行分析和预测，并结合现有的mTORC2/PKB的相关报道，确定小鼠PKB蛋白中mTORC2的磷酸化靶位点，通过构建野生型和激酶失活型蛋白激酶B的表达载体及该位点的突变体，并体外转录成mRNA，显微注射入小鼠1 细胞期受精卵，来探讨mTORC2在小鼠受精卵早期发育过程中的可能底物及作用位点，同时为揭示小鼠受精卵早期发育机制提供重要依据。