家蚕LDLRD蛋白的表达分析及其亚细胞定位

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低密度脂蛋白受体(Th.Lo.Densit.Lipoprotei.Receptor,LDLR)是一种细胞表面糖蛋白,主要功能是结合并内吞LDL,在胆固醇代谢中起关键作用。当LDLR功能缺陷时可导致家族性高胆固醇血(fanulia.hypercholesterolemia,FH)及早发冠心病。随着对低密度脂蛋白受体(LDLR)研究的不断深入,将有助于进一步了解高胆固醇血症及动脉粥样硬化(AS)等心血管疾病的发病机制和指导临床治疗。目前人们对LDLR基因表达的研究主要集中在人、兔、鼠上。因此,进一步研究LDLR在其他动物胆固醇平衡中的作用,以及进一步阐明LDLR的表达调控机制都将具有十分重要的意义。   从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经同源比对分析,与人小鼠等的低密度脂蛋白受体同源,因此,将其命名为家蚕低密度脂蛋白受体基因--Bmldlr。GenBank登录号是FJ602781.其开放阅读框长度45.bp,编码由151个氨基酸残基组成的肽链。经DNAstar软件分析其分子量为16.4.kDa,等电点为5.84。根据cDNA序列设计PCR引物,并分别引入EcoRI和Xh.I酶切位点,PCR产物双酶切后连入原核表达载体质粒pET-28a,成功的构建了重组质粒pET-28a(+)-Bmldlr。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为.mM的IPTG诱导表达,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在2.kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签+BmLDLRD)相符。融合蛋白先后经Sephade.G50分子筛层析及Ni亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA法测得抗体效价为1:12800。利用多克隆抗体对家蚕细胞Bm5进行亚细胞定位,结果表明BmLDLRD主要分布于细胞质中。同时也进行了荧光定量PCR分析不同组织及各发育时期该基因的表达差异,定量内参选用18SrRNA,结果显示在各组织中,脂肪体表达量最高,生殖器表达量次之,中肠中的表达量最低;在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,蛾的表达量最高,蛹次之,卵中较少,幼虫中表达量最少。本研究第一次对类家蚕的低密度脂蛋白受体进行了克隆表达及功能的研究,为今后家蚕低密度脂蛋白受体的研究创造了条件。
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