背景:任何癌症的发生和发展都与细胞的增殖和凋亡有关,只有抑制肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡,才能有利于肿瘤的治疗。从流行病学角度来说,胃癌是全世界发病率很高的肿瘤之一,大多数胃癌患者发现已经是晚期,而且临床治疗效果不佳。因此,早期发现和诊断就显得尤为重要了。肥胖是导致多种肿瘤发生的重要因素之一,这一观点已被公众所接受。一些研究表明,胃癌与异常脂质代谢相关,但具体机制研究较少。PLIN2,全称perilipin2,是一种脂肪分化相关蛋白,存在于多种组织和细胞中,主要与磷脂一起参与细胞中脂滴的贮存。有研究表明PLIN2在人胃癌的组织中的表达水平明显高于癌旁组织,PLIN2的表达水平也与胃癌的分期和分型相关,但PLIN2在人胃癌细胞中的具体生物学功能和机制尚未有研究。细胞铁死亡是近年来研究的热点,它实质是一种细胞内脂质过氧化应激反应,越来越多的研究表明,铁死亡在癌症的发生和发展中发挥重要的作用,但铁死亡与胃癌的相关性研究较少。PLIN2是否参与铁死亡在胃癌中的作用目前也尚未有研究。而PLIN2能否作为一种生物标志物和药物治疗的靶点来诊断和治疗胃癌尚不明确,因此,研究PLIN2对胃癌的发病机制就至关重要了。本文研究PLIN2基因及蛋白与人胃癌细胞系SGC7901和MGC803生物学功能的关系及相关机制,并解释脂质代谢紊乱导致胃癌的机理,推测PLIN2可能是诊断和治疗胃癌的潜在生物学标志物。本研究共分为四部分:第一部分高表达和低表达PLIN2在胃癌细胞株SGC7901和MGC803的建立及对细胞功能的影响方法:1、高表达和低表达PLIN2质粒载体的构建。2、分别将高表达和低表达PLIN2质粒载体转染至胃癌SGC7901和MGC803细胞系。3、分别用Rt-q PCR和免疫印迹验证转染后的胃癌细胞SGC7901和MGC803细胞中PLIN2的表达量。4、分别用流式细胞仪、CCK8、克隆集落、荧光显微镜原位细胞形态检测、ROS的方法对胃癌细胞系SGC7901和MGC803的增殖、凋亡、存活率和活性氧功能进行检测。结果:1、成功构建了高表达和低表达PLIN2质粒载体。2、转染高表达和低表达PLIN2后成功构建了胃癌稳转细胞株。3、Rt-q PCR和免疫印迹验证结果显示转染过表达PLIN2基因的细胞PLIN2的表达含量明显高于对照组,转染低表达PLIN2基因的细胞中PLIN2表达含量明显低于对照组。4、细胞功能结果显示与对照组相比,过表达基因PLIN2的细胞增殖能力,存活率明显增强,而凋亡能力和活性氧的含量明显减低,相反,低表达基因PLIN2的细胞增殖能力,存活率明显降低,而凋亡能力和活性氧的含量明显增高。第二部分裸鼠皮下人胃癌细胞肿瘤模型的构建及裸鼠人胃癌移植瘤组织PLIN2表达水平的验证方法:1、分别将人胃癌细胞过表达和低表达PLIN2基因稳转细胞SGC7901注射到五周大裸鼠nude mice(BALB/c nu/nu)皮下,定期测量肿瘤体积,裸鼠体长和体重,四周后处理裸鼠取出移植瘤组织并比较瘤重量。2、分别用免疫组化、免疫印迹、Rt-q PCR和HE染色的方法来检测裸鼠人胃癌移植瘤组织中PLIN2的表达水平。结果:1、成功构建裸鼠皮下人胃癌细胞肿瘤模型。过表达PLIN2细胞的裸鼠肿瘤体积和重量,裸鼠体重明显高于对照组;低表达PLIN2细胞的裸鼠肿瘤体积和重量,裸鼠体重明显低于对照组。2、过表达基因PLIN2裸鼠人胃癌移植瘤组织中的PLIN2水平明显高于对照组,低表达基因PLIN2裸鼠人胃癌移植瘤组织中的PLIN2水平明显低于对照组。第三部分RNA-seq对裸鼠人胃癌移植瘤组织测序及差异基因的生物信息学分析方法:1、将三组异种移植瘤组织送往北京华大基因组研究所BGI,采用磁珠法提取总RNA,在BGI seq-500系统上进行RNA序列分析。2、分别进行基因定量分析、差异基因分析、Venn分析、聚类分析、GO功能、KEGG Pathway、蛋白与蛋白互作等生物信息学分析。结果:1、比较每两组样品中由PLIN2基因调控的差异基因的数量,火山图显示NC与Ov PLIN2比较共检测到1138个差异基因,其中,上调基因120个,下调基因1018个;NC与Sh PLIN2共检测到627个差异基因,其中,上调基因282个,下调基因345个;Sh PLIN2与Ov PLIN2共检测到1516个差异基因,其中,上调基因1184个,下调基因332个。2、Venn图展示了基因在NC VS Ov PLIN2,NC VS Sh PLIN2 and Sh PLIN2 VS Ov PLIN2共同的差异基因为86个。3、聚类分析展示了三组样本在PLIN2基因调控下的差异基因的表达。4、GO功能分析共富集到20个GO功能中最明显的是脂质代谢功能。5、KEGG pathway分析共富集到20个通路,其中,差异最明显的通路即Ferroptosis pathway,该通路所包含的基因有ACSL3,ALOX15,LC3A,PRDM11,IPO7,这些基因在各组间都明显差异表达。说明这些基因受到PLIN2的潜在的调控。第四部分PLIN2促进胃癌发生机制的研究方法:1、分别采用Rt-q PCR、免疫印迹、免疫组化验证由PLIN2调节的铁死亡通路中重要的相关蛋白。2、尼罗红荧光染色及微量法分别检测过表达和低表达细胞内脂滴的大小和数量以及裸鼠人胃癌移植瘤组织中甘油三酯的含量和Lee’s指数对裸鼠体型肥胖程度的评估。结果:1、当PLIN2过表达时,铁死亡通路中ACSL3、ALOX15、LC3A、PRDM11表达量降低,IPO7表达量升高;当PLIN2表达量降低时,ACSL3、ALOX15、LC3A、PRDM11表达量升高,IPO7表达量降低。这一结果已经分别在Rtq PCR,免疫印迹,免疫组化中得到了验证。2、根据荧光强度显示过表达PLIN2的细胞内脂滴偏大和数量增多,低表达PLIN2的细胞内脂滴偏小,数量减少。微量法检测高表达PLIN2裸鼠的移植瘤组织中的甘油三酯的含量明显增多,低表达PLIN2裸鼠的移植瘤组织中的甘油三酯的含量明显减少。Lee’s指数评估显示高表达PLIN2的裸鼠体型明显大于低表达PLIN2的裸鼠体型。综上所述,我们的研究表明PLIN2在体内体外通过调控铁死亡通路中的重要基因来影响胃癌细胞的增殖和凋亡,也解释了脂质积聚可以导致胃癌的原因之一,其可能不但可以作为诊断的标志物,还可以作为治疗的新靶点。