藏族药二十五味珍珠丸对缺血性脑卒中大鼠的保护作用及其机制研究

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目的:本次实验研究采用改良的线栓法制备一种新型永久性大鼠大脑中动脉闭塞模型(PMcao)。探讨二十五味珍珠丸对大鼠神经行为学评分、大鼠急性脑梗塞坏死细胞体积、氧化应激活动因子、炎症应激因子、神经细胞保护作用及大鼠新生脑血管形成机制的重要影响,从而深入研究使用藏族药二十五味珍珠丸对于脑缺血性大鼠和脑卒中患者的神经保护作用及其作用机制,为临床用药提供依据。方法:(1)将90只4周龄的SPF级SD雄性大鼠平均分配成6组(n=15):模型组、尼莫地平阳性药组(12 mg·kg-1)、假手术实验组、二十五味珍珠丸高剂量给药组(400 mg·kg-1)、二十五味珍珠丸中剂量给药组(200 mg·kg-1)、二十五味珍珠丸低剂量给药组(100 mg·kg-1)。假手术实验组不进行插线处理,模型组、尼莫地平阳性药组及二十五味珍珠丸给药组大鼠则是采用经过改良的线栓法制作永久性大鼠脑缺血模型,大鼠大脑中动脉血管闭塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion model,PMcao)。造模手术前,假手术实验组和模型组每天对大鼠进行称重,按着(1 ml/100 g)给予UP水进行灌胃,每天每只大鼠给药1次,连续给药24天,在造模手术前1 h给药1次,尼莫地平组和二十五味珍珠丸给药方案同前。(2)检测指标:(1)行为学检测:参照Zea-Longa评分标准测定存活大鼠的神经行为学评分及24小时死亡率。(2)脑组织生理病理检测:TTC染色法观察大鼠脑梗死体积,HE法观察大鼠脑组织形态学改变。(3)炎症、氧化应激因子检测:使用ELISA检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素6(IL-6)、过氧化氢酶(CAT)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达情况。(4)Notch信号通路:使用RT-PCR检测大鼠脑组织中Notch1、Jagged 1、Hes 1m RNA表达水平。(5)神经再生:使用RT-PCR检测各组大鼠受体脑细胞再生组织基质中Bcl-2m RNA的表达水平,Western blot法检测各组大鼠受体脑细胞再生组织中细胞凋亡关键因子caspase-3蛋白的表达水平。(6)大鼠微血管内皮细胞再生检测:使用ELISA法分别检测大鼠血清中血管生成素1(Ang1),脑源性神经营养因子(BDNF),受体酪氨酸激酶2(Tie-2),转化生长因子-β1(TGF-β1),基质金属蛋白酶-9(MMP9)的表达水平;使用RT-PCR法检测各组大鼠脑组织再生组织细胞基质中内皮抑素(ES)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)的表达水平;使用免疫荧光分析法检测各组大鼠脑细胞再生组织中血管内皮生长因子(VEGF)、CD34阳性细胞的比例。结果:(1)行为学检测:与模型组相比,二十五味珍珠丸低、中、高剂量组可显著降低永久性大脑中动脉闭塞大鼠神经行为学评分及死亡率,有明显的统计学差异(P<0.001,0.01)。(2)脑组织生理病理影响:二十五味珍珠丸给药组与模型组相比较,二十五味珍珠丸低、中、高剂量组可显著降低脑梗死体积(P<0.001),且呈剂量依赖关系。HE染色镜检结果显示,模型组大鼠大脑皮层梗死区组织结构疏松,坏死严重,二十五味珍珠丸给药组梗死区面积减小明显,病变交界区结构较正常,与假手术实验组相近。(3)血清炎症、氧化应激因子检测:与假手术实验组比较,模型组大鼠早期血清中促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β阳性表达水平显著性上升(P<0.001,0.05);与模型组大鼠比较,检测到二十五味珍珠丸可大幅下调大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的阳性表达水平(P<0.001,0.01,0.05),低剂量实验组IL-6表达无显著性差异,尼莫地平组也可减轻大鼠血清炎症因子(P<0.001,0.05)。与假手术实验组比较,模型组大鼠中SOD、CAT平均含量显著下调,而大鼠MDA平均含量大幅上调(P<0.001)。与模型组比较,二十五味珍珠丸给药组和尼莫地平组大鼠SOD、CAT含量都有所上调,MDA含量下降其中以二十五味珍珠丸高剂量给药组更为显著(P<0.001)。(4)Notch信号表达通路:与假手术实验组相比,模型组的Notch l、Jagged l及Hes l m RNA表达水平无显著性差异。二十五味珍珠丸中剂量给药组,高剂量给药组的Notch l,Jagged l,Hes l m RNA表达水平明显大幅高于模型组(P<0.001),二十五味珍珠丸低剂量给药组Notch l m RNA水平明显大幅高于模型组(P<0.01),但Jagged l、Hes l m RNA表达水平无显著性差异。(5)神经再生:模型组中Bcl-2 m RNA神经细胞表达水平与假手术实验组相对比显著下降,caspase-3蛋白表达含量显著上升(P<0.001);二十五味珍珠丸中、高剂量给药组Bcl-2 m RNA表达水平与模型组相对比显著上升(P<0.001),低剂量给药组,尼莫地平给药组两组效果均无显著性统计学差异;二十五味珍珠丸低、高给药剂量组中caspase-3表达含量显著下降(P<0.001,0.01),低剂量给药组无显著临床统计学意义,尼莫地平给药组具有统计学差异(P<0.05)。(6)血管再生:(1)二十五味珍珠丸对脑缺血大鼠血清中Ang1、Tie2、MMP-9影响:与假手术实验组相比,模型组Ang1水平显著降低,Tie2、MMP9水平明显升高(P<0.001,0.01)。与模型组相比给药组Ang1水平升高,Tie2、MMP9表达水平下降(P<0.01,0.05),低剂量给药组均无明显统计学差异。(2)模型组与假手术实验组相对比上调了TGF-β1的表达,低剂量组给予二十五味珍珠丸后表达无统计学差异,中、高剂量给药组与模型组相比TGF-β1表达大幅度降低(P<0.01,0.05)。模型组实验中BDNF平均表达水平与假手术实验组相比有所下降(P<0.001),给予二十五味珍珠丸组与模型组相比,平均表达水平显著升高(P<0.01,0.05)。(3)二十五味珍珠丸对局部脑血管缺血模型大鼠脑缺血组织部位ES、TSP-1m RNA表达水平的影响:与假手术实验组相比,模型组大鼠局部脑缺血组织ES、TSP-1m RNA表达平均水平显著高于假手术实验组(P<0.001);与模型组相相比,给予药物组大鼠局部脑缺血组织ES、TSP-1 m RNA表达平均水平有所下降(P<0.001)。(4)二十五味珍珠丸对患有脑缺血大鼠脑组织细胞VEGF、CD34表达的影响:与模型组相比,VEGF假手术实验组阳性细胞表达数量明显有所下降(P<0.05),二十五味珍珠丸治疗后VEGF阳性细胞表达数量明显有所上升(P<0.001,0.01)。与模型组相比较,CD34阳性细胞数在假手术实验组中有所上调(P<0.001),二十五味珍珠丸用药后CD34阳性细胞数量也明显有所上调(P<0.001,0.01)。结论:二十五味珍珠丸对于脑缺血性脑卒中大鼠具有显著保护大鼠大脑的作用,其药理机制可能与抗炎、抗氧化、促进神经细胞增殖、抑制神经细胞凋亡及促进大脑血管细胞新生发育有关。
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