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牛GV期卵母细胞相对于成熟卵母细胞的冷冻保存要困难很多,但在远距离运输卵母细胞时,必须进行冷冻保存。因此,开发GV期卵母细胞冷冻保存技术对于充分利用未成熟卵母细胞、特别是远距离屠宰场卵巢卵母细胞保存具有重要的现实意义。海藻糖(trehalose)是一种类似于蔗糖的非还原性双糖,能形成玻璃状保护层保护处于极端条件下的生命体,因此探索海藻糖作为非渗透性冷冻保护剂替代常规玻璃化冷冻保护剂(CPA)中蔗糖、用于冷冻保存GV期卵母细胞的可能性,并找到最适替代浓度是本研究的目的之一。有研究证明,常规溶解冷冻保护剂的缓冲介质DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)中的主要成分NaCl,对胚胎的超低温冷冻具有一定的危害,但其对卵母细胞尤其是GV期卵母细胞的保护作用未见报道。因此,本研究的目的之二,是以氯化胆碱代替NaCl,以及联合海藻糖和氯化胆碱用于GV期卵母细胞的冷冻保存,探索其保护效果。此外,本研究的目的之三,是研究冷冻损伤的机制,凋亡基因和周期基因相对表达量的差异性。研究内容和结果如下：1.不同浓度海藻糖对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻的效果(1)在对不同浓度海藻糖作为非渗透性保护剂对卵母细胞存活能力评价的实验中,发现冷冻组中0.5M海藻糖组活力强的比率不如0.5M蔗糖组(39.8%vs52.5%,p<0.05),但是0.5M海藻糖组的总的存活的卵母细胞比率比0.5M蔗糖组高(70.1%vs63.6%,p<0.05),其他冷冻组之间无显著差异。(2)在CPA中添加不同浓度海藻糖后透明带硬度测定实验中,0.5M蔗糖组中透明带溶解时间(93±2.5min)显著少于其他冷冻组,0.5M海藻糖组(95.5±2.6min)、0.3M海藻糖组(93.3±3.8min)除外(p<0.05)。(3)卵母细胞发育能力与对照组相比,冷冻显著降低了胚胎的卵裂率和囊胚率(p<0.05),1M海藻糖组、0.8M海藻糖组、0.1M海藻糖组冷冻保存的卵母细胞不能发育到囊胚期,0.5M蔗糖组与0.5M海藻糖组、0.3M海藻糖组胚胎的卵裂率和囊胚率差异不显著(p>0.05),且0.5M蔗糖组(13.9±2.3%)和0.5M海藻糖组(12.2±0.9%)、0.3M海藻糖组(10.4±2.8%)的胚胎卵裂率显著高于其它组(0.8M海藻糖组(7.7±4.3%)除外)(p<0.05)；0.5M蔗糖组(2.5±2.2%)和T3(1.5±1.3%)、0.3M海藻糖组(1.3±2.2%)的囊胚率要高于其它组,但差异不显著。(4)检测体外培养成熟的卵母细胞的纺锤体形态,实验结果发现,冷冻保护剂中浓度相同(0.5mol/L)两种糖具有类似保护效果,冷冻液中添加不同浓度的海藻糖会起到不同程度的保护作用。实验结论：海藻糖可以作为蔗糖的替代物用于GV期卵母细胞玻璃化冷冻,O.3mol/L-0.8mol/L均能达到一定的保护作用,但0.5mol/L为最适宜替代浓度。2.牛GV期卵母细胞冷冻损伤的分子机制(1)通过细胞凋亡检测试剂盒免疫荧光染色法检测卵母细胞凋亡,实验结果表明：0.5M蔗糖组(4.1±0.9%)、0.5M海藻糖组(5.5±2.6%)卵母细胞未凋亡的比率显著低于(p<0.05)新鲜卵组(13.o±0.9%)；(2)通过检测细胞凋亡相关基因BAX inhibitor和BAX,以及细胞周期相关基因CDC2和CyclinBI的mRNA相对表达量,发现经过冻融的卵母细胞,其mRNA表达水平明显受到影响,凋亡基因BAX和周期相关基因CDC2表达水平上调,另两个表达水平总体下调。实验结论：冷冻引起GV期卵母细胞凋亡加剧,冷冻损伤主要是通过引起凋亡的途径进行的。3.改良磷酸盐缓冲液(mPBS)配制玻璃化冷冻液卵母细胞冷冻效果评价1)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,卵母细胞成活率0.5M蔗糖组(24.2%)显著低于对照组(90.4%)、mPBS+0.5M蔗糖组(42.2%)和mPBS+0.5M海藻糖组(47.0%)(p<0.05)。mPBS+0.5M蔗糖组和mPBS+0.5M海藻糖组在统计学上差异不显著,但后者高于前者(p>0.05)。2)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,透明带溶解时间冷冻组0.5M蔗糖组(103±4.16mmin)显著长于mPBS+0.5M海藻糖组(86.67±5.69min)和mPBS+0.5M蔗糖组(89.00±9.54min)(p<0.05)。3)CPA中氯化钠以氯化胆碱替代后,卵母细胞成熟培养后体外受精,受精胚胎的卵裂率,冷冻组显著低于对照组(45.4±0.9%,p<0.05),mPBS+0.5M蔗糖组(28.4±0.5%)和mPBS+0.5M海藻糖组(26.8±2.1%)显著高于0.5M蔗糖组(14.2±2.6%)(p<0.05)；囊胚率0.5M蔗糖组(2.3±2.0%)、mPBS+0.5M蔗糖组(3.2±0.1%)低于mPBS+0.5M海藻糖组(3.9±0.9%),三组在统计学上差异不显著(p>0.05)。实验结论：DPBS中的钠离子对牛GV期卵母细胞冷冻有一定的危害,以氯化胆碱替代,能起到一定的保护作用,并且非渗透性保护剂0.5mol/L海藻糖替代蔗糖,与氯化胆碱配合使用,能达到更优效果。