玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)是存在于谷物、啤酒、牛奶等食品中的类雌激素霉菌毒素,可严重影响动物及人类的健康。研究发现ZEA不仅具有生殖毒性、肝毒性、遗传毒性、免疫毒性,还可引起动物睾丸间质肿瘤的发生,但关于ZEA诱发睾丸间质肿瘤的机制目前尚不明确。本实验以小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)为材料,研究了低浓度的ZEA暴露对TM3细胞的细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞周期及其相关调控蛋白的影响,DNA损伤及原癌、抑癌基因的影响,细胞间隙连接通讯及其连接蛋白的影响,以揭示ZEA诱发睾丸间质肿瘤的机制。主要研究内容如下：1.ZEA对TM3细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。不同浓度的ZEA(0、5、10、20μg/L),染毒TM3细胞72h,应用MTT法检测ZEA染毒后对TM3细胞增殖活力的影响；AnnexinV-FITC/PI双荧光染料对细胞进行染色,流式细胞仪检测ZEA染毒TM3细胞凋亡情况,同时通过PI荧光染色法检测细胞周期的变化；通过免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4, Bcl-2基因家族成员的表达情况。结果显示,低浓度ZEA对TM3细胞的增殖具有促进作用,且存在剂量-效应关系,在ZEA染毒浓度为20μg/L时,TM3细胞的相对增殖活力明显提高(P<0.05); ZEA染毒后,分布于G1/G0期的TM3细胞量逐渐减少,开始向S期和G2期进行转化,而细胞周期调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表达量随ZEA染毒浓度的升高而呈上升趋势；细胞凋亡检测结果显示,10、20μg/L ZEA染毒后TM3细胞的凋亡率极显著下降(P<0.01),但20μg/L ZEA染毒组较10μg/L ZEA染毒组凋亡率略有上升(P>0.05)；与对照组比较,各染毒组凋亡调控蛋白Bax/Bcl-2灰度值比值均显著降低(P<0.05)。2.ZEA对TM3细胞DNA损伤及原癌、抑癌基因的调控作用。ZEA染毒TM3细胞72h,应用Western Blot检测磷酸化组蛋白yH2AX的蛋白表达水平,同时检测原癌基因c-Myc、c-Fos、c-Jun,抑癌基因p53、PTEN的蛋白表达水平：免疫荧光法检测yH2AX灭光焦点的形成情况。结果显示,TM3细胞内形成的yH2AX荧光焦点数量及形成荧光焦点的细胞数量都随着ZEA染毒浓度的升高而增加,20μg/L ZEA染毒组只有26.21%的细胞未形成荧光焦点,其余细胞均有不同程度的DNA损伤；与对照组比较,各染毒组yH2AX蛋白表达量均显著升高(P<0.05)；随着ZEA染毒浓度的升高,原癌基因c-Myc、c-Fo c-Jun蛋白表达水平呈上升趋势,各染毒组与对照组比较均有显著差异(P<0.05),相反抑癌基因p53及PTEN蛋白表达水平则呈下降趋势,且差异极显著(P<0.01)。3.ZEA对TM3细胞间隙连接通讯及其连接蛋白的影响。ZEA染毒TM3细胞72h。Western Blot检测细胞间隙连接蛋白Cx32、Cx43的蛋白表达水平；FITC荧光染料染色Cx43,在荧光显微镜下观察Cx43在细胞内的分布情况；划痕标记染料示踪技术(SLDT法)检测TM3细胞暴露于ZEA后,相邻细胞之间GJIC功能的变化。结果显示,随着ZEA染毒浓度的升高,TM3细胞连接蛋白Cx32、Cx43的表达量呈下降趋势,各染毒组与对照组比较均有显著差异(P<0.05)；荧光显微镜下观察到Cx43在正常细胞内呈现点线状结构分布于细胞膜周围,然而在ZEA染毒后Cx43原有的点线状结构遭受破坏,荧光强度减弱,其分布逐渐趋向于细胞质和细胞核膜上；SLDT技术检测发现小分子染料荧光黄(LY)在相邻细胞间的扩散距离随着ZEA染毒浓度的升高而呈现缩短趋势,10μg/L ZEA以上染毒组均较对照组有极显著差异(P<0.01),表明GJIC功能受到了ZEA的抑制。结论认为,低剂量ZEA可引起TM3细胞DNA的损伤,同时伴随原癌、抑癌基因及凋亡调控蛋白Bal-2、Bax表达的异常及细胞间隙连接通讯的抑制,这些被认为是肿瘤发生的关键机制。ZEA可导致TM3细胞基因组稳定性降低,其生长调控机制的平衡状态遭受破坏,细胞增殖、分化发生异常变化,若细胞的持续增殖及恶性转化未及时受到抑制,最终可导致肿瘤的发生。