论文部分内容阅读
背景和目的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)主要表现为骨骼肌、脂肪、肝脏等靶组织器官的胰岛素敏感性下降。骨骼肌是人体最大的胰岛素利用组织,对全身葡萄糖代谢起到了至关重要的作用。因此,从骨骼肌组织入手,通过筛查遗传性T2DM实验动物骨骼肌组织的异常表达基因或者突变基因,研究其对T2DM的作用,就成为探索T2DM发生机制和治疗靶点的一个有效途径。前期,我们在长爪沙鼠近交系培育过程中,偶然发现一个分支的长爪沙鼠空腹血糖较高,糖耐量受损,且这一性状具有遗传性。抑制消减杂交发现真核蛋白延长因子1α2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,eEF1A2)在T2DM长爪沙鼠骨骼肌中表达显著降低。eEF1A2在真核细胞蛋白翻译阶段,以GTP依赖的方式促进翻译延长和密码子识别准确性。近期研究发现,胰岛素可调节eEF1A2表达和转位。eEF1A可促进酵母葡萄糖摄取,糖原合成和脂类转运。此外,eEF1A2通过活化PI3K/Akt通路参与多种细胞事件。这提示,在骨骼肌中eEF1A2可能能通过PI3K/Akt/GLUT4通路调节葡萄糖摄取和胰岛素敏感性,eEF1A2的异常表达与T2DM病理进程相关。为验证这一假说,本研究将在动物水平和细胞水平上研究eEF1A2对骨骼肌糖代谢的作用和分子机制。实验方法我们首先通过同源扩增和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆长爪沙鼠eEF1A2 cDNA序列全长,并进行同源性分析。随后,利用三种T2DM动物模型,分析骨骼肌中eEF1A2表达及其甲基化变化。在正常肌管和两种胰岛素抵抗细胞模型中,探讨eEF1A2对胰岛素刺激后肌管的葡萄糖摄取,胰岛素信号活化和脂质生成利用相关基因表达的调节作用。最后,通过腺相关病毒注射实现db/db小鼠骨骼肌eEF1A2过表达,检测其在动物水平上对葡萄糖耐受和代谢相关基因的调节作用。实验结果1.利用RACE技术克隆长爪沙鼠eEF1A2基因cDNA全长1812 bp,CDs长1392 bp,编码463个氨基酸。同源性分析显示,长爪沙鼠eEF1A2核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为88.6%,94.0%和93.8%;其氨基酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为100%,99.9%和99.9%。这提示长爪沙鼠可能是研究人类eEF1A2蛋白功能的良好实验动物。2.在自发性T2DM长爪沙鼠、db/db小鼠和高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的T2DM小鼠中,其骨骼肌eEF1A2表达均显著降低,且这一变化不依赖于eEF1A2启动子区域甲基化水平的改变。3.胰岛素可在60 min内显著上调正常饮食小鼠和高脂诱导T2DM小鼠骨骼肌eEF1A2表达,但高脂小鼠eEF1A2表达增加量低于正常饮食小鼠。这表明胰岛素可上调骨骼肌eEF1A2表达,且在T2DM下这一作用减弱。4.在分化的C2C12肌管细胞中,eEF1A2过表达显著增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取,GLUT4膜转位,PI3K,Akt,ERK,m TOR,GSK-3β胰岛素信号分子的活化,以及脂质生成相关基因乙酰辅酶A羧化酶α(Acetyl CoA carboxylaseα,Acc-1),脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,Fas),甘油三酯水解基因:脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,Lpl),β-氧化基因:肉碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl transterase-1,Cpt-1)的表达。这一结果提示,在正常骨骼肌细胞中,eEF1A2促进胰岛素敏感性。5.分别利用高浓度胰岛素和棕榈酸构建胰岛素抵抗细胞模型。在高浓度胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型中,eEF1A2过表达显著增加肌管中胰岛素刺激的葡萄糖摄取,GLUT4膜转位,PI3K,ERK,GSK-3β活化,且这一作用可被Akt抑制剂MK-2206 2HCl和PI3K抑制剂LY294002逆转。这表明在高浓度胰岛素诱导的胰岛素抵抗细胞模型中,eEF1A2能通过激活PI3K/Akt通路增强胰岛素敏感性。然而在棕榈酸诱导胰岛素抵抗模型中,eEF1A2过表达显著降低了葡萄糖摄取,GLUT4膜转位,以及Akt,ERK,mTOR的活化。这表明在棕榈酸诱导的胰岛素抵抗模型中,eEF1A2加剧了肌管的胰岛素抵抗。6.将eEF1A2过表达的腺相关病毒注射到db/db小鼠后肢骨骼肌中,实现eEF1A2骨骼肌过表达。注射两周后,与对照相比,eEF1A2过表达小鼠表现为更强的葡萄糖和胰岛素不耐受,且内质网应激基因CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,Chop)和免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip)表达显著增加。因此,eEF1A2加剧T2DM动物胰岛素抵抗。结论:T2DM下调骨骼肌eEF1A2表达,且不依赖于其启动子区域甲基化水平。eEF1A2表达受胰岛素调节,在正常肌管细胞中促进胰岛素刺激的葡萄糖摄取和信号活化;但在棕榈酸诱导的胰岛素抵抗细胞和db/db小鼠模型中,加剧胰岛素抵抗。这提示,eEF1A2有望成为治疗T2DM的新靶点,为临床治疗T2DM提供新思路和理论基础。