松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）侵染引起的一种毁灭性松林病害,其病原松材线虫被列为我国一级林业有害生物,对我国森林生态安全造成严重威胁。除了存在广泛的寄主、媒介昆虫以及现有的防控措施不能满足需求外,松材线虫自身的快速繁殖和适应机制是松材线虫快速扩张的重要因素。松材线虫的繁殖能力是影响其致病性的重要因素,而雌雄比是决定种群繁殖能力的重要因子。因此,对松材线虫雌雄比的变化及性别决定机制研究有利于从繁殖生物学角度阐释松材线虫的入侵和扩散机制。雌雄比是现代进化生态学的核心概念。除了阐明性选择、种群动态和进化轨迹之间的关系外,它也是适应性分配策略的焦点。在这种分配策略中,个体通过调整对雌性和雄性的相对投资来匹配当前和预期的适合度收益。本论文重点研究了不同环境因素对松材线虫后代雌雄比的影响和性别决定相关基因的功能,具体研究结果如下:主要研究结果包括以下几个方面:1.通过野外调查,发现松材线虫的雌雄比在0.95～2.22范围内变动,说明松材线虫可能根据环境的不同调整后代的雌雄比以适应环境的变化。首先在实验室内进行模拟实验,对不同龄期的雌雄比进行了统计,发现三龄幼虫（L3）、四龄幼虫（L4）和成虫（Adult）时期的雌雄比保持不变,大约为1.90,表现为雌性偏倚。将二龄幼虫（L2）分别培养48,56,72,96 h,其中培养48和56 h时,雄幼虫发育为雄成虫的速率要高于雌幼虫发育为雌成虫的速率;而在72和96 h时,雌雄幼虫发育为成虫的速率相同。为了便于统计和避免雌雄幼虫发育为成虫的速率不同造成的影响,下面实验涉及的雌雄比均为松材线虫成虫时期的雌雄比。2.温度、种群密度、亲本年龄和营养对松材线虫雌雄比、生长和发育的影响。将L2置于不同的低温环境下:0℃、4℃、10℃处理8 d后接种在灰葡萄孢上。结果表明,不同温度处理后代卵的大小、孵化率以及雌雄比（收集卵并培养至成虫时,下同）均没有差异,同样的,7 d后的种群数量也没有差异显著性;随着种群密度的增加（2,000,10,000,50,000）,亲本体积减小,后代卵的大小和数量减少,但是后代雌雄比并未变化,大约为1.90;亲本年龄的变化也未对后代雌雄比造成影响,成虫在第1、3、5和7 d后代的雌雄比分别为1.93±0.08、1.93±0.06、1.94±0.06和1.84±0.04。将L2接种到生长浓度为1*PDA、1/4*PDA、1/16*PDA的灰葡萄孢菌丝上,统计松材线虫发育和雌雄比变化,发现取食不同浓度PDA生长菌丝的松材线虫,其亲本长度、宽度和体积存在显著差异,且雌虫的体积减少百分比大于雄性,亲本成虫的雌雄比差异不显著;但是不同处理的后代雌雄比、平均每个雌虫产生的后代数和卵的大小存在显著差异:雌雄比分别为1.85±0.05 a、1.67±0.04 ab和1.41±0.05 b;数量分别为44.4±3.23a、44.44±3.10a、15±0.44b;卵的体积分别为16292.6±178.2μm~3、15144.2±15144.2μm~3、14114.8±134.4μm~3;为了排除雌雄比的变化是由存活率差异造成的,进一步对不同处理卵到成虫阶段的存活率进行了研究,结果表明存活率差异不显著,分别为66.06%、66.44%和64.09%。因此,推测PDA浓度影响了灰葡萄孢的生长进而影响了松材线虫后代雌雄比变化。说明松材线虫亲本可以根据不同的营养状态调整后代的雌雄比变化。3.为了研究松材线虫后代雌雄比是否由初始雌雄比变化导致的,进行性别特异性标签的筛选。通过随机扩增多态性DNA标记（RAPD）或基因组重测序对雌虫或雄虫特异性标签筛选。通过使用1200条随机引物分别对雌雄虫基因组进行RAPD扩增,共扩增出5624条主条带,但并未筛选到特异性标签;进一步的通过雌雄虫的基因组重测序分析,从测序结果挑选了80个雌雄虫差异片段进行验证,也未发现雌雄虫基因组存在特异性标签。4.为了进一步研究松材线虫性别决定的分子机制,对松材线虫性别决定基因Bx-sex-1和Bx-tra-1进行了基因克隆和生物学功能分析。通过荧光定量PCR对Bx-sex-1在松材线虫不同发育阶段表达量进行分析,结果表明,在卵时期其相对表达量最高,而在L2时期最低,从L2时期到adult时期相对表达量逐渐升高。荧光定量PCR结果显示Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组中均为单拷贝。通过RNAi沉默Bx-sex-1基因表达,卵的孵化率下降,雌雄比降低。松材线虫Bx-sex-1基因在卵的发育过程和性别决定中具有重要作用。Bx-tra-1基因表达分析,荧光定量PCR和western blot的结果均表明,Bx-tra-1基因在L2时期表达最高。免疫组织化学染色显示TRA-1蛋白在L2龄期线虫的肠道和尾部表达较高。松材线虫Bx-tra-1基因可能在L2时期性别决定和分化中起重要作用。综上,低温处理L2、不同种群密度和亲本年龄不影响后代的雌雄比,不同营养条件是影响后代雌雄比的重要因素,并且推测后代雌雄比的变化是由初始雌雄比变化导致的。性别决定系统和性别决定基因可能对初始性别比例产生影响。对松材线虫雌雄基因组进行RAPD扩增和重测序,未发现雌雄虫特异性标签。在性别决定的分子机制中,性别决定相关基因Bx-sex-1在卵的发育过程和性别决定中具有重要作用,而Bx-tra-1在L2时期的性别决定和分化起着重要作用。