背景和目的：近年来,一些临床研究结果显示：患有根尖周炎或根尖脓肿的未发育完全的年轻恒牙,经适当治疗后其牙根尖仍能持续发育成形。随着人们对根尖乳头干细胞(Stem cells from apical papilla,SCAP)的发现和深入研究,证实根尖乳头干细胞介导的牙本质再生在这一过程中发挥着极其重要的作用。2006年,Sonoyama等从人未发育完全的年轻恒牙根尖乳头组织中分离出一种新的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)--根尖乳头干细胞,具有高度的增殖、自我更新和多向分化潜能,在一定的诱导条件下可向成骨/成牙本质、脂肪、软骨、肌肉、神经元等细胞分化。SCAP来自发育中组织,具有比牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)更强的群体倍增能力.端粒酶活性、细胞迁移能力及再生分化潜能。研究发现SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的重要来源,在牙根的形成和发育过程中起着重要的作用。SCAP表现出的特点决定了其不仅仅是一种研究牙根发育时成牙本质细胞分化机制的细胞模型,而且是极其优秀的早期牙源性干细胞来源,可用于牙髓牙本质再生和牙根再生,在临床上具有良好且广泛的应用前景。干细胞的增殖和分化受到多种内在机制和微环境因素的影响。炎症通过产生大量炎性因子改变成体干细胞的微环境,不同的炎性因子对其刺激后可影响细胞的增殖和分化甚至引起细胞凋亡,从而影响干细胞介导的组织再生[14-16]。牙髓炎、根尖周炎的发生发展是一个由多种细胞因子参与的复杂生理过程,当牙髓组织和根尖周组织受到炎症刺激时能够产生自身免疫应答,不同的粒细胞会粘连及迁移至损伤部位,在炎症发生发展的过程中,由巨噬细胞产生的炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TN-α)及由中性粒细胞释放的炎性因子如白细胞介素一1p(interleukin-1p,IL-1p)和白细胞介素—8(interleukin-8,IL-8)的表达量明显升高,这对于组织的损伤及修复有着极其重要的作用,这些炎性因子作用于干细胞后能引起一系列的变化继而改变干细胞的生物学功能。另有研究显示持续性的慢性炎症刺激环境能降低组织中干细胞的增殖、迁移能力,并可以通过改变干细胞内在信号通路来抑制其组织再生修复的潜能。同时病变程度与炎性因子含量之间存在着一定的相关性,故患有牙髓炎、根尖周炎的年轻恒牙,其不同病变程度炎性因子的表达量也不一样,可能对SCAP的存活率、再生分化能力有不同的影响,继而影响根尖的持续发育程度。本实验采用体外培养纯化的SCAP为细胞模型,模拟体内炎症微环境应用炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8对SCAP进行干预,研究其对SCAP增殖、成骨/成牙本质分化所起的生物学效应,从而明确炎症微环境对SCAP增殖和分化的调控作用；为进一步阐明根尖周组织的损伤修复、再生机制提供理论依据,同时也为进一步研究SCAP的生物学特性、成骨/成牙本质分化机制、牙髓牙本质再生及牙根再生等组织工程应用提供一定的实验基础。方法：1、人根尖乳头干细胞体外生物学特性的研究完整拔除因正畸治疗或者智齿阻生的牙根尚未发育完全且无牙体牙周疾病的年轻恒牙,分离根尖乳头组织,通过改良组织块法原代培养SCAP,并利用有限稀释法克隆化培养进行纯化,于倒置显微镜下观察SCAP原代细胞和传代细胞的生长状态及形态学特征；采用免疫荧光染色技术检测其间充质干细胞标志物STRO.1,波形丝蛋白,角蛋白和CD24的表达；采用MTT法检测细胞连续10d的OD值并绘制生长曲线；利用结晶紫染色法检测细胞克隆形成情况；流式细胞仪分析SCAP的细胞周期。采用条件培养基(矿化诱导液、成脂诱导液及成软骨诱导液)分别对SCAP进行诱导培养3周后,行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性染色、茜素红染色、油红-O染色和阿利新蓝染色,以验证其具备多向分化能力；并采用免疫荧光染色技术检测成骨／成牙本质的相关标志物碱性磷酸酶、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1, DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达情况。2、炎性因子影响人根尖乳头干细胞增殖能力的实验研究取生长状态良好的SCAP接种至96孔板,饥饿24h后行浓度效应和时间效应实验,每组5复孔,重复3次。浓度效应：更换为含或不含TNF-α、IL-1β.IL-8终浓度为0、1、2.5、5、10、50ng/mL的1%FBS的a-MEM培养基,于第4d终止培养；时间效应：更换为含或不含终浓度10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1p.10ng/mL IL-8.10ng/mL TNF-α+5ng/mL IL-1β+10ng/mL IL-8的1%FBS的a-MEM培养基,分别于1、3、5、7、9d终止培养,MTT法检测其对细胞增殖活性的影响。按上述分组培养10d后结晶紫染色检测其对细胞克隆形成率的影响；按上述分组培养2d后流式细胞仪检测各组的细胞周期,每组3复孔,重复3次。3、炎性因子影响人根尖乳头干细胞成骨／成牙本质能力的实验研究取生长状态良好的SCAP细胞接种到6孔培养板上,饥饿24h后,对照组更换为矿化诱导液进行培养；实验组更换为分别含10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β.10ng/mL IL-8.10ng/mL TNF-α+5ng/mL IL-1β+10ng/mL IL-8的矿化诱导液。培养14d后终止培养行ALP染色、茜素红染色及相应的半定量检测；按上述分组行矿化诱导3、7、14d后,提取总RNA,采用qRT-PCR法检测成骨/成牙本质相关标志物ALP.DSPP.DMP-1基因的表达情况,每组3复孔,重复3次。结果：1、人根尖乳头干细胞的体外生物学特性用改良组织块法原代培养5d后,倒置显微镜下可见细胞从组织块边缘游出并呈放射状生长,细胞形态多为长梭形成纤维样细胞,少数为纺锤状或多角形。有限稀释法克隆化培养获得纯化的SCAP并传代以进一步扩大培养,传代后细胞呈典型的成纤维细胞样,生长能力强,长满瓶底后整体呈漩涡状排列。免疫荧光检测结果显示抗STRO-1、抗波形丝蛋白、抗CD24染色呈阳性表达,抗角蛋白染色呈阴性表达,符合间充质来源干细胞的特征。MTT检测结果显示,SCAP的细胞生长曲线整体呈“S”形,经历潜伏期、对数生长期、平台期三个过程。SCAP培养10d后经结晶紫染色后镜下可见细胞增殖明显呈集落样生长,细胞克隆形成率为18.1%-21.3%。细胞周期检测结果显示G0/G1期细胞为68.12%,G2/M期为5.73%,S期为26.16%,绝大多数细胞处于静止期和合成前期,且S期比例高,在一定程度上说明SCAP的增殖能力强。经矿化诱导3w后ALP染色和茜素红染色阳性,倒置显微镜下可见胞浆呈蓝紫色及大量矿化结节的形成；经成脂诱导3w后油红O染色阳性,倒置显微镜下可见胞质内大量红色大小不等的脂滴形成；经成软骨诱导液诱导3w后阿利新蓝染色阳性,胞浆呈蓝色。对矿化诱导3w后的细胞爬片行免疫荧光染色检测抗ALP、DSPP、DMP-1的表达情况,检测结果显示均呈阳性表达。2、炎性因子对人根尖乳头干细胞增殖能力的影响MTT法检测结果显示：10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、10ng/mL IL-8刺激时增殖作用最为明显,而更高浓度的炎性因子的刺激并不能加强促增殖作用；在时间效应的实验中,在10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、10ng/mL IL-8单刺激及共刺激下,与对照组相比,各实验组在第3、5d时对SCAP的增殖具有明显的促进作用,而在第7、9d时增殖活性受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。各炎性因子刺激组推进细胞周期进程并提高了细胞的克隆形成率,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、炎性因子对人根尖乳头干细胞成骨/成牙本质能力的影响本研究结果显示,经10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1p刺激后SCAP的碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的数量明显降低,ALP mRNA的表达量亦明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而10ng/mL IL-8组无明显差别；同时矿化诱导7d时,各实验组中SCAP的DSPP和DMP-1的mRNA表达则明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；14d时各实验组中DMP-1的mRNA表达有所降低,而各组DSPP的mRNA表达无明显变化。结论：本实验通过改良组织块法成功地获得了原代SCAP,利用有限稀释法克隆化培养获得了纯化的SCAP,并采用免疫荧光染色法对SCAP进行了初步鉴定,证实了其为间充质源性干细胞；采用矿化诱导、成脂诱导及成软骨诱导实验验证了SCAP具备多向分化能力；模拟体内炎症环境应用炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8对SCAP进行干预,结果表明炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8可以促进SCAP的增殖,调控细胞的成骨/成牙本质分化能力。本实验结果为进一步研究炎症微环境对SCAP的成骨/成牙本质分化调控机制提供了研究基础；同时也为进一步阐明根尖周组织的损伤修复、再生机制提供理论依据。