论文部分内容阅读
草甘膦N-乙酰转移酶（GAT）能通过N-乙酰化的作用使草甘膦脱毒，在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。本实验通过PCR程序首次从提取的土壤总DNA中扩增出草甘膦N-乙酰转移酶基因（gat基因）。酶解后插入表达载体pGEX-6p-1，获得重组质粒pGEX-gat。将它转入大肠杆菌DH5α，获得可以表达GST-GAT融合蛋白的重组菌株。基因测序表明，与来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的AX543338核苷酸序列有99.3％的同源性，与AX543339和AX543340分别有93％和95.2％的同源性。将GAT酶用亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳，结果显示gat基因表达了17kDa的蛋白质，与来自GAT酶基因序列所推导的分子量一致。对该酶的酶学性质进行了分析，结果表明，该酶的最适温度为30℃，最适反应pH为7。同时检测了6种金属离子对酶活性的影响，发现虽然GAT的活性不依赖于金属离子的存在，但单价离子K<+>、Na<+>和双价离子Mg<2+>和Mn<2+>对GAT酶均有激活作用。相比之下，单价离子的激活作用高于双价离子，其中Na<+>的激活作用最强，使酶相对活性提高了48.3％；而Ca<2+>有明显的抑制作用，使活性下降63.7％。
叶灼病是甘蔗主要病害之一，由一种植物性毒素albicidin所引起。我室从欧文氏菌（Erwinia herbicola）中分离到一种可降解albicidin的AlbD酶。通过序列比较发现AlbD酶和酯酶拥有相同：motif-LXXXGXXG──GXSXG。因此，选用不同链长的酯化合物作为底物进行酯酶活性检测，发现对脂肪酸链长C<,2>-C<,8>的酯均有活性。前期研究工作发现AlbD酶$40位点可能是该酶活性中心的一部分，改变该位点可能会改变该酶活性。为了弄清该位点诱变对酶活性的影响，我们利用新的PCR诱变技术对AlbD酶S40位点进行饱和突变，将该位点的Ser变为其它19种氨基酸，获得了19种不同的突变子，测试了不同突变子的脱毒活性和酯酶活性。结果表明，S40A和S40R突变子分别使AlbD酶脱毒活性提高1.1倍和1.2倍。以对硝基苯丁酸酯为底物，S40Q使AlbD酶酯酶活性提高1.2倍；以对硝基苯戊酸酯为底物，S40G使活性提高1.3倍。而S40N、S40L和S40W的脱毒活性和酯酶活性均显著降低。这一研究结果为弄清该酶的作用机理以及进一步研发利用奠定了基础。