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研究背景及目的:肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,目前临床上最主要的治疗方法是手术切除,而中晚期肝癌仍缺乏有效的治疗手段。传统的化疗药物不具有对肝癌组织的靶向性,常会引起较为严重的副作用。部分患者甚至因此放弃治疗,导致疗效低下,极大程度地影响了治疗效果和预后情况。另一方面,在药物靶向递送的载体使用上,人工合成的材料如纳米金、脂质体等,虽然可以在体内进行药物递送,但是存在免疫原性及一定的毒性,影响药物效果、引发机体炎症反应。本研究通过将靶向肝癌的肽段与外泌体相接合,使其具有携带生物活性物质能力的同时,又能够靶向肝癌组织。microRNA参与多项生命活动,miR-125b在抑制肝癌发生、发展中发挥重要作用。我们将miR-125b作为治疗药物,以改造的外泌体为载体治疗肝癌。期望在开发肝癌新型治疗策略上有所突破,为肝癌治疗提供新思路及方法。方法:1.在数据库中检索肝癌患者血清外泌体与正常人血清外泌体中miR-125b表达,预测其与肝癌的相关性;利用荧光探针及荧光定量PCR技术检测各肝癌细胞系中miR-125b的表达;miR-125b mimic转染肝癌细胞后,应用CCK-8试剂盒检测细胞系的增殖情况、应用划痕实验、Transwell迁移实验检测其迁移能力、应用Westerm blot技术分析上皮-间质转化相关蛋白的变化。2.在临床标本中病理组化检测肝癌特异性标志物GPC-3的表达;应用Western blot技术检测肝癌细胞系中GPC-3蛋白的表达并选出高表达细胞;体外验证GPC-3靶向肽段L5(氨基酸序列RLNVGGTYFLTTRQ)靶向能力。3.收集并鉴定小鼠胚胎成纤维细胞分泌的外泌体;利用点击化学的方法将L5连接至上述获得的外泌体上,应用荧光显微镜观察确定合成效率;利用电穿孔的方法将miR-125b装载至上述外泌体中。4.构建小鼠肝癌原位模型,利用小动物活体成像设备观察上述外泌体在肿瘤组织的聚集;以尾静脉注射给药的方式治疗荷瘤小鼠,检测对肝癌进展的抑制作用效果。结果:1.肝癌患者血清外泌体中miR-125b表达水平下降,且与肝癌的预后呈负相关(p<0.01);miR-125bmimic转染肝癌细胞后,EMT相关蛋白显示,发生间质-上皮样(MET)转化;划痕及Transwell迁移实验都证明肿瘤迁移能力减弱。2.L5具有对GPC-3高表达肝癌细胞的靶向性。3.外泌体能与L5相结合,且合成后仍具有对GPC-3高表达肝癌细胞的靶向性;miR-125b mimic可以通过外泌体进入细胞发挥对肿瘤迁移抑制作用。4.荷瘤小鼠尾静脉注射后,与L5连接的外泌体和普通外泌体相比,能在肿瘤聚集,且对肿瘤的生长具有抑制作用。结论:外泌体与L5连接后获得对GPC-3高表达肝癌细胞靶向能力;miR-125b对肝癌细胞迁移、生长具有抑制作用;外泌体靶向载药可以增加药物在肝癌组织的聚集,在肿瘤治疗上具有重大应用潜能及前景。