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DNA甲基转移酶3A(DNAmethyltransferase3A,DNMT3A)作为重新甲基转移酶在生物个体发育过程中起DNA甲基化修饰作用,并以表观遗传的方式调控基因的表达。近年来研究表明,DNMT3A在多种正常组织中呈不同程度的广泛性低表达,但在多种肿瘤组织中呈异常高表达模式。我国肝癌组织中DNMT3A表达模式及其与肝癌发生发展的关系尚不清楚,对这一问题的探讨和研究将有助子揭示肝癌发生的表观遗传学机制。
本研究应用Real-time quantitive PCR、免疫组织化学、Western blot等方法分析了肝癌组织及肝癌细胞系中DNMT3A的表达情况及表达部位,以了解DNMT3 A在肝癌中的表达模式及其与肝癌发生发展的相关性。应用RNA干扰(RNAinterfering RNAi)的方法特异性抑制了肝癌细胞及癌旁细胞中DNMT3A的表达,分别应用Cell Counting Kit-8(CCK)、软琼脂克隆形成实验以及流式细胞仪技术检测DNMT3A沉默后对肝癌细胞增殖能力、克隆形成能力以及细胞周期的影响,以了解DNMT3A通过影响肝癌细胞的哪些生物学行为与功能参与肝癌的发生发展。应用基因芯片高通量分析DNMT3A在肝癌中可能调控的基因,并以Real-time PCR验证,以PTEN基因为目标基因研究DNMT3A对抑癌基因的调控机制,应用MSP(Methylated Specific PCR,MSP)和亚硫酸氢盐测序(BisulriteSequencing,BGS)的方法检测PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化状态和甲基化程度,探讨DNMT3A调控肿瘤抑制基因表达的可能机制。研究结果表明:
1.肝癌中DNMT3A在RNA水平存在表达升高现象,高表达率为64％。石蜡组织切片免疫组化结果显示DNMT3A在癌旁组织和肝癌组织中的表达部位主要为细胞浆。
2.与正常肝细胞系相比,癌旁细胞系和肝癌细胞系中DNMT3A的表达呈不同程度的异常高表达,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)X基因(HBx)的体外转染上调了癌旁细胞系QSG-7701中DNMT3A的表达水平。
3.RNAi抑制了肝癌细胞SMMC-7721中DNMT3A的表达,影响了肝癌细胞的生长、抑制了肝癌细胞克隆形成的能力。
4.基因芯片结果显示,DNMT3A表达抑制导致了153个基因表达上调,26个基因表达下调。通过生物信息学软件分析发现,71%的上调基因5端存在CpG岛,在此CpG岛序列中存在近80种潜在的转录因子结合位点。
5.肝癌中PTEN存在表达降低现象,去甲基化药物5-杂氮胞苷处理肝癌细胞系SMMC-7721,发现PTEN基因表达上调。
6.MSP的结果显示,DNMT3A表达抑制后PTEN基因启动子区的DNA修饰由甲基化状态转变为未甲基化状态,BGS与MSP一致,显示DNMT3A表达抑制使PTEN基因启动子区6个CG位点均出现去甲基化现象。
以上研究结果提示,DNMT3A在肝癌组织及肝癌细胞系中表现为高表达模式,可能通过促进细胞增殖、恶性转化能力等参与肝癌的发生发展。同时,DNMT3A在肝癌中参与调控众多肿瘤相关基因表达,DNA甲基化修饰作用是调控肝癌相关基因的表观遗传途径之一。