目的：本实验通过观察不同浓度的17β-雌二醇对体外培养人牙髓细胞增殖、矿化、细胞周期以及碱性磷酸酶活性的影响，以探讨17β-雌二醇对人牙髓细胞生物学特性的影响及作用机制，为将17β-雌二醇作为一种新型的诱导剂应用于人牙髓组织的修复再生提供实验依据。方法：选取因正畸或阻生新鲜拔除的健康、完整、无龋、无隐裂年轻恒牙，在无菌条件下取出牙髓组织，采用组织块酶消化法获取人牙髓细胞并进行原代培养。当细胞生长至铺满孔底80％时进行传代，从而获得大量可供实验用的种子细胞。取第4代对数生长期人牙髓细胞爬片，用SABC法进行波形蛋白和角蛋白免疫组化染色鉴定细胞来源，倒置显微镜下观察。将处于对数生长期的第4代人牙髓细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，制成细胞悬液，以10⁴cells/ml分别接种于五个96孔培养板，每板余出一列培养孔不加液，其余各孔每孔液量150μl，培养24h。观察细胞贴壁情况良好后，弃上清液，PBS缓冲液清洗3次，吸干，将细胞随机分为5个实验组、1个对照组和1个空白对照组，每组选6个孔。实验组：在相应的有细胞孔内加入150μl用含2%活性碳吸附胎牛血清的无酚红高糖DMEM培养液配置的终末浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L的17β-雌二醇。对照组：在相应的有细胞孔内加入150μl含2%活性碳吸附胎牛血清的无酚红高糖DMEM培养液培养。空白对照组：在相应的无细胞孔内加入150μl含2%活性碳吸附胎牛血清的无酚红高糖DMEM培养液培养。连续培养，每天换液以维持药物浓度恒定。MTT比色法检测17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖的影响：分别于培养48h和72h时随机取出一个96孔培养板，向所测孔内加入5mg/ml MTT20μl，继续孵育4h，弃孔内液体，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡5min，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定492nm下各孔的吸光度值。流式细胞术检测17β-雌二醇对人牙髓细胞的细胞周期的影响：选用10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L的17β-雌二醇作为试验组，与对照组（未加药物组）进行细胞周期试验。按照细胞周期试剂盒说明书操作，进行流式细胞仪分析。检测17β-雌二醇对人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性的影响：分别在药物作用7天和14天时随机取出一个96孔培养板，弃上清液，PBS缓冲液清洗3次，吸干，每孔加入50μl0.1%TritonX-100，置4℃冰箱过夜。观察细胞已无完整结构，经震荡后，按碱性磷酸酶试剂盒说明书加入碱性磷酸酶底物，每孔100μl，培养箱内置30min，最后每孔加入0.2mol/L NaOH50μl终止反应，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定410nm下各孔的吸光度值。茜素红染色法检测17β-雌二醇对人牙髓细胞矿化结节形成的影响：取生长良好的第4代人牙髓细胞，按2×10⁴cells/ml密度爬片于盖玻片后置于六孔板中培养，分为未诱导组和实验组，每组5个复孔。根据17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖和对碱性磷酸酶影响的结果，选用10^-8mol/L17β-雌二醇作为实验组，以含2%活性碳吸附胎牛血清的无酚红的高糖DMEM培养液作为未诱导组，隔日换液。分别在第7、14、28天，随机取出未诱导组与实验组各一个盖玻片，PBS冲洗细胞3次，4%甲醛溶液固定10～15min，PBS再洗3次，1%茜素红染色10min，最后用蒸馏水清洗，直至吸出的液体无色为止。倒置相差显微镜观察、拍片。采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析，多重比较采用S-N-K法。实验数据以均数±标准差表示，P<0.05为有统计学意义。结果：1体外分离培养的人牙髓细胞波形蛋白染色阳性、角蛋白染色阴性，证实细胞为来自中胚层间充质细胞，符合实验要求。2与对照组相比，在一定浓度范围内17β-雌二醇能促进人牙髓细胞的增殖和细胞周期进程，提高其碱性磷酸酶活性，并增强体外连续培养人牙髓细胞的矿化能力，其中以10^-8mol/L的17β-雌二醇作用最为明显。结论：1采用组织块酶消化法可成功培养出人牙髓细胞，培养所得细胞生长旺盛，形态呈均一的成纤维细胞样，可复层生长，符合实验要求。217β-雌二醇可促进体外培养的人牙髓细胞增殖，推进细胞周期进程并提高其碱性磷酸酶活性和矿化能力，说明17β-雌二醇对人牙髓细胞向成牙本质样细胞增殖、分化和矿化有一定的定向诱导作用，显示了17β-雌二醇作为一种新型的诱导剂应用于牙髓组织修复、再生等组织工程领域的可行性。