第一部分 骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的：下腰痛是一种主要由椎间盘退行性改变引起的严重影响人类生活质量的临床疾病。细胞治疗是生物治疗的一种,在治疗退行性疾病方面具有良好的前景。成人间充质干细胞是一种很有吸引力的细胞源,不仅可以直接用于椎间盘退行性疾病的治疗,还可以与组织工程支架结合,移植入病变区域进行治疗。方法：使用健康成人骨髓标本进行实验。按照Majumdar的方法,首先使用梯度密度离心法分离单核细胞,再通过贴壁培养得到骨髓间充质干细胞。观察间充质干细胞的生长情况,检测其贴壁率、倍增时间,绘制生长曲线。使用流式细胞术检测免疫表型。分别进行成骨、成脂、成软骨方向的诱导,检测细胞的干性。结果：顺利得到了成人间充质干细胞。光镜下观察,细胞生长状态良好。对其贴壁率、倍增时间和生长曲线的实验证明得到的间充质干细胞具有良好的增殖能力。流式细胞术检测免疫表型,发现干细胞表面CD29,CD44, CD 166表达阳性,而CD34, CD44, HLA-DR表达为阴性。三系诱导分化结果发现,间充质干细胞可以分化为骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞,具有良好的分化潜能。结论：我们通过实验得到了骨髓间充质干细胞,为下一步实验奠定了细胞基础。第二部分静电纺丝技术制备含生长因子TGF-β1的组织工程椎间盘支架及表征评价目的：椎间盘退变与髓核钙化密切相关。静电纺丝技术是一种可以制备具有细胞外基质类似结构的纳米纤维生物活性支架的有效方法。方法：实验中,我们使用两种方法制备纳米纤维支架。第一种采用单轴混纺的方法,以聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和TGF-β1为原料制备纳米纤维支架。第二种方法采用同轴静电纺丝的方法制备纳米纤维支架,其中内层原料是TGF-β1和PVA,外层原料是PLGA。支架制备完成后进行表征评价,通过扫描电镜(SEM),透射电镜(TEM),高效液相色谱分析(HPLC),傅立叶红外光谱(FTIR)等方法进行了检测。结果：通过摸索条件,成功制备了单轴和同轴静电纺丝支架。SEM结果显示,两种方法制备的支架具有相似的纺丝直径以及蛋白释放特性。单轴方法制备的静电纺丝支架具有更好的亲水性,另外加入蛋白质可以增加支架的亲水性。傅立叶红外检测证明我们成功制备了含有生长因子TGF-β1的两种支架。结论：单轴和同轴电纺技术都能在合适的条件下制备含生长因子TGF-β1的生物活性支架。不同制备方法以及是否含有蛋白质都会影响支架表面的亲水性。成功制备两种生物活性支架为进一步的体外实验提供了条件。第三部分体外实验：含TGF-β1的静电纺丝支架及低氧条件对hMSCs向髓核样细胞分化的影响目的：间充质干细胞具有良好的增殖和分化潜能,可以作为髓核再生的合适种子细胞。体内环境的变化可以影响MSCs的分化方向。方法：实验中,我们分别在制备好的静电纺丝生物活性支架上接种MSCs细胞,检测细胞在支架上的增殖和粘附特性。之后,在常氧条件和低氧条件下进行培养,并在21天后使用qPCR的方法检测细胞分化情况。结果：体外细胞实验发现,采用单轴的静电纺丝方法及加入蛋白质对于细胞增殖和粘附具有促进作用。另外,制备的含生长因子的TGF-β1生物活性支架以及低氧条件都具有促进间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用。结论：结果表明,含TGF-β1的静电纺丝支架以及低氧条件都具有促进hMSCs向髓核样细胞分化的作用。由TGF-β1, PVA和PLGA为原料制备的静电纺丝支架可以为髓核再生提供新思路。