研究背景变应性鼻炎（Allergic rhinitis,AR）是上呼吸道慢性炎症反应性疾病,以反复喷嚏、清涕和鼻痒为主要临床特征,它是多种免疫活性细胞和细胞因子参与的由IgE介导的鼻腔黏膜组织Th2免疫反应。在变应性鼻炎的发病机制的研究过程中,嗜酸性粒细胞（Eosinophil,EOS）是研究的重点和热点,EOS是粒细胞白细胞的一种,来源于骨髓CD34⁺祖细胞,它在组织中数值的增高更是被作为炎症或过敏性反应严重程度的标志,很多研究表明减轻嗜酸性粒细胞性炎症反应是治疗AR的关键环节之一。EOS的趋化、募集和浸润的过程依赖于嗜酸性粒细胞特异性的细胞因子和趋化因子,嗜酸性粒细胞活化趋化因子（Eotaxin）被认为是EOS向病变部位组织迁移的重要免疫调节因子,大量的研究表明Eotaxin是通过与CCR3受体结合募集EOS向炎症组织迁移并激活它们。CCR3是一种七次跨膜偶联蛋白受体,最早被发现在EOS细胞表面上表达,它属于CC类趋化因子受体家族,是Eotaxin的唯一受体。Eotaxin属于唯一通过CCR3进行信号识别的免疫趋化因子,CCR3/Eotaxin径路在哮喘模型的小鼠实验中参与了嗜酸性粒细胞募集至肺部的过程,在变应性皮炎中,此径路也参与了嗜酸性粒细胞募集至皮肤和肺部的过程,因此阻断CCR3/Eotaxin径路可以为变应性疾病的治疗提供新的方法。本文将通过构建CCR3基因敲除小鼠,进行了体内和体外两部分实验,在体外实验中,原代培养CCR3^-/-小鼠骨髓EOS,观察EOS的增殖、成熟和凋亡情况。在体内实验中,我们成功构建了OVA致敏激发的变应性鼻炎小鼠模型,对比观察CCR3^+/+及CCR3^-/-小鼠的喷嚏、流涕等临床表现,观察小鼠的生长发育情况、主要器官的变化情况,检测小鼠骨髓、外周血、鼻腔黏膜组织中CD34+嗜酸性祖细胞变化情况及成熟EOS的变化,检测EOS脱颗粒情况,研究敲除CCR3基因后对AR的Th1/Th2免疫平衡的影响。通过上述内容研究CCR3对OVA致敏激发的变应性鼻炎小鼠的嗜酸性粒细胞的全面作用,以期为变应性鼻炎的防治探寻新的方法。第一部分CCR3基因敲除小鼠嗜酸性粒细胞的变化特征目的:运用基因敲除的方法,构建CCR3基因敲除的小鼠模型,骨髓体外原代培养嗜酸性粒细胞,了解CCR3^-/-小鼠与正常Balb/c野生型小鼠之间骨髓嗜酸性粒细胞的变化特征。方法:运用同源重组的技术敲除小鼠CCR3基因,自CCR3^-/-小鼠的股骨取骨髓原始细胞在体外进行培养,诱导刺激骨髓原始细胞分化成熟为嗜酸性粒细胞,倒置显微镜下观察嗜酸性粒细胞的增殖情况,qRT-PCR检测嗜酸性粒细胞脱颗粒蛋白mRNA表达情况,Annexin V-FITC/PI双染法检测EOS细胞凋亡率。结果:1、体外培养EOS的细胞计数结果显示,在第10、12、14天CCR3基因敲除组EOS的增殖相比正常Balb/c野生型对照组明显减少,有统计学差异（P<0.01）。2、EOS细胞凋亡率检测结果显示,细胞培养基中加入或不加入10ng/ml IL-5情况下,CCR3基因敲除组的EOS细胞凋亡率均高于正常Balb/c野生型对照组,差异有统计学意义（P<0.0001）。3、qRT-PCR检测EOS脱颗粒蛋白ECP、EPO、MBP mRNA的表达,其结果显示:CCR3基因敲除组EOS原代培养后其ECP、EPO、MBP mRNA的表达量明显低于正常Balb/c野生型对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:CCR3基因可以调节嗜酸性粒细胞的生长发育,敲除CCR3基因可抑制EOS的增殖及成熟,促进其凋亡。第二部分CCR3基因敲除对变应性鼻炎小鼠发病机制的影响目的:构建CCR3基因敲除小鼠模型,研究CCR3基因敲除对OVA致敏的变应性鼻炎小鼠嗜酸性粒细胞的影响。方法:应用基因敲除的技术特异性敲除CCR3基因,以不同剂量的卵清蛋白（OVA）致敏激发制作变应性鼻炎小鼠模型,观察小鼠AR的临床表现,应用HE染色法检测小鼠鼻腔黏膜中EOS的浸润情况、心肝肾重要组织器官的病理变化。通过瑞氏染色检测小鼠的骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中EOS及CD34+祖细胞数量的改变。采用实时荧光定量-聚合酶链反应技术检测小鼠骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中CCR3及EOS颗粒蛋白mRNA的表达量变化。通过IHC方法检测小鼠骨髓、外周血、鼻腔粘膜组织中EOS颗粒蛋白蛋白量水平。应用流式细胞仪技术检测小鼠骨髓体外培养的嗜酸性粒细胞的数量变化以及细胞凋亡情况,试剂盒检测小鼠外周血及鼻腔灌洗液中IFN-γ、IL-4、IgE的变化。结果:（1）在变应原的刺激下,CCR3基因敲除小鼠(CCR3^-/-小鼠)与正常Balb/c野生型小鼠(CCR3^+/+小鼠)相比鼻部症状不明显,主要脏器病理结构无改变,鼻腔黏膜病理改变明显减轻。（2）瑞氏染色计数检测显示CCR3^-/-变应性鼻炎小鼠的骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例明显低于CCR3^+/+变应性鼻炎小鼠（P<0.05）。（3）CCR3^-/-变应性鼻炎小鼠与CCR3^+/+变应性鼻炎小鼠相对比,骨髓、外周血以及鼻腔灌洗液中的嗜酸性粒细胞脱颗粒蛋白:阳离子蛋白（ECP）、主要碱性蛋白（MBP）及过氧化物酶（EPO）的mRNA和蛋白量明显减低（P<0.05）。（4）OVA刺激致敏激发小鼠后,取小鼠骨髓细胞进行培养,检测体外培养的小鼠骨髓嗜酸性粒细胞数量及凋亡情况,CCR3^-/-小鼠的嗜酸性粒细胞数量的增殖低于CCR3^+/+小鼠、凋亡率高于CCR3^+/+小鼠;CCR3^-/-小鼠的骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中CD34+嗜酸性祖细胞数量低于CCR3^+/+小鼠。（5）与正常对照组小鼠相比,OVA致敏激发的变应性鼻炎小鼠血清中IFN-γ水平明显降低,IgE、IL-4水平明显升高。与CCR3^+/+变应性鼻炎小鼠相比,CCR3^-/-小鼠变应性鼻炎小鼠IFN-γ水平升高,IgE、IL-4水平降低,提示CCR3基因在变应性鼻炎疾病的发生发展过程的的Th1细胞因子和Th2细胞因子失衡中有着非常重要的作用。结论:CCR3基因敲除,对小鼠的生长发育没有明显影响,可抑制嗜酸性粒细胞的分化发育、迁移及组织浸润。同时CCR3基因可能是致使变应性鼻炎Th1细胞因子和Th2细胞因子之间失衡的原因之一