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以蛋白质纳米孔,如α-溶血素纳米孔,作为传感器件的纳米孔单分子检测技术凭借其低成本、操作简单和无需标记等优势在单分子分析、单分子化学反应研究和DNA测序等方面具有重要的研究和应用价值,研究对象包括DNA、金属离子和有机小分子等多种物质。蛋白质纳米孔的结构和通道尺寸限制了检测物的研究范围,可通过基因定点突变、化学修饰、装备适配器以及结合其他技术扩大蛋白质纳米孔的应用范围。本论文用新合成的全-6-季铵基-β-环糊精(per-6-quatemary ammonium-β-cyclodextrin,p-QABCD)装备基因工程化的α-溶血素突变蛋白质(M113R)7αHL纳米孔,作为纳米反应器和传感器,实现在单分子水平实时监测谷胱甘肽(GSH)和二价镉离子(Cd2+)络合反应的不同反应路径、反应中间产物和最终产物。本文还通过将α-溶血素突变蛋白质(M113R)7αHL纳米孔与脂质体信号放大体系相结合,构建新的纳米孔单分子检测平台,扩大了纳米孔的检测范围。主要研究内容总结如下:1.蛋白质纳米孔传感器实时监测二价镉离子与谷胱甘肽的单分子化学反应利用新合成的分子适配器p-QABCD装备基因工程化的α-溶血素突变蛋白质(M113R)7 αHL纳米孔形成新型纳米反应器和传感器,即p-QABCD-(M113R)7 αHL,成功实现在单分子水平对GSH和Cd2+的络合反应的实时原位监测,并辨认络合反应的不同路径、反应中间产物和最终产物。研究表明,溶液的pH显著影响GSH与Cd2+络合产物的络合比例。pH=7.4时,GSH与Cd2+络合反应的最终产物为Cd(GSH)2,pH=9.0时,最终产物为Cd(GSH)2和Cd2(GSH)2。其中,Cd2(GSH)2的形成遵循两种路径:一、一个Cd2+首先结合两个GSH分子的巯基形成Cd(GSH)2,然后,第二个Cd2+结合去质子化的氨基形成Cd2(GSH)2;二、两个Cd2+分别结合同一个GSH分子的巯基和去质子化的氨基形成Cd2(GSH)1,然后,第二个GSH分子的巯基和去质子化的氨基结合Cd2(GSH)1的Cd2+形成Cd2(GSH)2。本工作实现了在单分子水平无标记和无化学修饰研究金属离子和生物小分子的反应,对理解细胞内重金属的解毒机理和拓展纳米孔单分子技术的研究领域具有重大意义。2.脂质体信号放大体系应用于纳米孔单分子检测技术利用α-溶血素突变蛋自质(M113R)7 αHL纳米孔与脂质体信号放大体系相结合,构建了一个新的纳米孔单分子检测平台,扩大了纳米孔单分子检测的研究范围。α-溶血素易于插入脂质体的磷脂双分子层释放出包裹在脂质体内部的信号探针分子,但当脂质体特异性地结合检测物在其表面形成保护层,会阻止信号探针分子的释放,根据信号探针分子的释放量可实现对检测物的定量检测。本研究用IP6作为信号探针分子,以biotin为生物识别物质,合成了表面修饰biotin的IP6-脂质体(biotin-IP6-脂质体),结合蛋白质(M113R)7 αHL纳米孔,通过对信号探针分子IP6的电流阻塞事件的间隔时间进行统计间接地实现对avidin的定量检测。这一体系的建立拓宽了蛋白质纳米孔单分子检测技术的研究范围。