集约化养猪场废弃物处理和排放过程中抗生素迁移及相关抗性基因的变化研究

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基于预防疾病和促进生长的目的,抗生素在养殖业中大量使用。我国是养猪第一大国,每年所产生的大量养猪粪便和废水中含有未被生物体消化利用的抗生素。当这些养殖废弃物通过施肥、灌溉和排放等方式扩散到环境中时,其中残留的抗生素会给周围环境细菌带来选择性压力,诱导其抗性的增强及抗生素抗性基因(ARGs)的增殖,增加了环境病原菌获得抗生素抗性的机会,给抗生素的临床治疗带来很大困难,严重威胁人类健康。ARGs作为一种新型污染物,其在我国养猪业中的污染现状及迁移规律,目前尚缺乏相关的系统性研究。  本文通过固相萃取(SPE)及超高效液相色谱质谱联机(UPLC-MS/MS)方法测定了养猪粪便和废水、施肥和未施肥土壤、受纳水体及沉积物等相关样本中养殖业常用的四环素类(TCs)和磺胺类(SAs)抗生素的浓度;使用聚合酶链式反应(PCR)和定量PCR方法定性、定量检测了样本中与TCs和SAs相关的ARGs的相对丰度和分布;使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和高通量测序方法分析了样本中细菌群落结构的变化。在此基础上,揭示了ARGs在养猪场中的迁移规律,阐明了多种养猪废弃物处理工艺对ARGs的影响,取得以下主要结论:  (1)以北京市某典型集约化养猪场为研究对象,考察了TCs、SAs两类抗生素及其相关ARGs在废弃物排放或处理过程中的扩散规律,探讨了影响ARGs沿程扩散和传播的相关因素,结果表明,TCs和SAs的浓度及相关ARGs的相对丰度总体上沿着粪便的处理和废水的排放途径逐渐降低。粪便和废水中TCs的最高检出浓度分别为166.7 mg kg-1和388.7μg L-1,而SAs的最高检出浓度仅分别为98.4μg kg-1和7.6μg L-1,所检测ARGs的相对丰度处于2.74×10-6-1.19范围内。抗生素的检出浓度、ARGs的检出率和相对丰度冬季高于夏季。粪便处理途径中抗生素和ARGs的消减程度大于废水排放路径。核糖体保护机制(RPP)四环素类抗性基因(TRGs)的丰度水平在上游粪便、废水样本中均占优势,而在下游下降明显,而外排泵(EFP) TRGs和磺胺类抗性基因(SRGs)表现则较稳定。粪便样本中,4种RPP TRGs的相对丰度之和与TCs的总浓度呈现显著正相关;水体样本中,SRGs的相对丰度与SAs的总浓度呈现强正相关。水塘沉积物是ARGs随废水排放的一个主要“汇”。整合酶基因与部分ARGs显著相关,表明整合子密切参与ARGs的传播。在所调查的各类样本中,COD、氨氮、总氮、总磷等污染物浓度与部分ARGs显著相关;在粪便和土壤样本中,含水率同部分ARGs显著相关,说明环境因子同样影响ARGs在环境中的传播。  (2)在北京市典型养猪场的研究基础上,开展了山东省九家集约化养猪场中TCs和SAs两类抗生素及相关ARGs的大规模区域性调研,发现总体上两类抗生素在养猪粪便和废水中的检出浓度高于北京猪场,表明山东省养猪场抗生素的使用剂量相对较高。同样,土壤中抗生素的总检出浓度也高于北京猪场,这是由于山东省养猪场多数缺乏粪便处理设施,致使土壤易受污染。受纳水体沉积物中的抗生素浓度变化与上游养猪废水中相似,表明其受废水排放影响显著。九家养猪场相关样本中ARGs的变化规律与北京猪场类似,呈现沿程逐渐降低的趋势。土壤和水体沉积物中,ARGs的相对丰度在夏季均高于冬季,这可能与夏季排水量大导致猪场污染物易向外扩散有关。进一步考察了不同养猪废弃物处理工艺对ARGs的影响,发现发酵床对ARGs的去除效果最好,而化粪池和静置风干效果最差,革兰氏阴性菌可能是养猪废弃物处理工艺中ARGs的主要宿主菌群。  (3)基于北京和山东多家养猪场的研究结果,重点考察了猪粪高温堆肥过程中土霉素(OTC)和磺胺二甲嘧啶(SMN)的降解及相应ARGs的演变。结果表明,经过32天的高温堆肥,OTC和SMN降解率分别达到了89.9%和100%,SMN的降解主要依赖于非生物作用,OTC的降解则是生物和非生物共同作用的结果。堆体中添加的抗生素没有阻碍粪便的腐熟,但诱导了其中相关ARGs的增殖。在整个堆肥过程中,RPP TRGs基本保持稳定,而EFP TRGs、tetX和SRGs的相对丰度在堆肥中温期显著提高。相关性分析表明,高温和高浓度抗生素残留对RPP TRGs在堆肥过程中的驻留有利,而其他TRGs和SRGs则更适于较低温度和较低抗生素残留的环境。整合酶基因与多种机制ARGs(EFP TRGs、tetX和SRGs)存在显著正相关,说明整合子介导的基因水平转移对堆肥过程中ARGs的扩散起到重要作用。
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