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目的Caspase依赖的细胞凋亡是细胞死亡很重要的方式,同时也是多种抗肿瘤治疗共同激活的效应途径。Caspase-8作为起始的凋亡蛋白已经广为人知,但是最近很多研究发现了caspase-8还有其他的功能。细胞死亡是一个多细胞器参与的生命活动,细胞通过各种方式相互调节,来清除已经发生不可逆转的损害的细胞。溶酶体,作为细胞回收中心,为肿瘤细胞活跃代谢提供物质基础。快速的分裂和侵袭的癌细胞严重依赖有效的溶酶体功能,除此之外,富含蛋白水解酶的溶酶体也辅助参与细胞死亡过程。本研究探究了与肿瘤细胞存亡相关的caspase-8的非凋亡的功能,通过阻断正反馈的级联放大的凋亡作用,寻找其新的死亡机制。探求其与溶酶体稳态失衡的关系,溶酶体功能失调的表现以及调控方式,caspase-8如何协同溶酶体促进肿瘤细胞死亡的分子机制,为肿瘤治疗提供新的策略。最后为caspase-8衍生短肽靶向溶酶体治疗提供理论基础。方法1.本研究利用CRISPR/Cas9技术,在肿瘤细胞的基因层面上一一敲除需要研究的caspase蛋白,并通过基因组测序,蛋白水平,以及功能层面上验证敲除的有效性,消除了Knock down所导致的微量蛋白的残留对实验的影响,来验证HeLa以及MCF-7细胞凋亡途径的起始以及激活过程。2.肿瘤细胞外源过表达caspase-8,通过Western blot检测凋亡指标的变化,Annexin V-FITC/PI流式细胞分析以及使用监测细胞凋亡的工具(GC3AI)可视化的检测细胞凋亡的发生,探究细胞死亡的原因。3.通过构建caspase-8的突变体以及使用RNA干扰技术降表达caspase-8的下游蛋白水平,来验证蛋白水解酶的功能与细胞死亡的关系。4.通过过表达Bcl-xL以及Bcl-2抗凋亡蛋白,检测保护线粒体能否营救过表达caspase-8导致的死亡。5.以HeLa细胞为模型,通过基因敲除技术,构建稳定敲除caspase-3/7/8/9的细胞系(4KO),通过观察二维克隆的形成以及生长曲线来分析4KO细胞的增殖能力,细胞划痕实验以及Transwell迁移来检测敲除细胞对细胞迁移能力的影响,来分析敲除细胞的表型。6.在4KO细胞水平上,分析阻断级联放大的途径与外源表达caspase-8致死的关系。7.使用LysoSensor,lysoTracker和吖啶橙染料对细胞溶酶体进行染色,观察表达外源caspase-8后,溶酶体的分布和形态以及内部PH是否发生了明显的改变,验证死亡与溶酶体的关联性。8.使用检测LGALS3斑点的聚集以及使用免疫荧光技术检测溶酶体中蛋白水解酶的分布变化,验证过表达caspase-8细胞是否发生了溶酶体的损伤。9.构建不同caspase-8的截断体,使用免疫共沉淀技术,分析与溶酶体上V-ATPase复合物相互作用的结构域,外源表达截断体的细胞的增殖以及对溶酶体压力的敏感性检测,来验证caspase-8衍生短肽在抗肿瘤中的潜在价值。结果1.HeLa细胞以及MCF-7细胞凋亡的发生均依赖于线粒体途径对凋亡信号的传递,过表达Bcl-xL以及Bcl-2蛋白保护线粒体或者下调Bid以及Bax,减少了MOMP的发生,均可以阻断凋亡过程。2.外源表达caspase-8可以不依赖于死亡配体受体结合介导DISC对其活化,便可以启动凋亡过程,Western blot检测到下游凋亡指标caspase-3/7以及PARP的剪切,同时使用了Annexin V/PI流式细胞分析发现凋亡率增多。3.过表达了caspase-8失活突变(C8CI)和不能被剪切激活的caspase-8突变(C8UC)也可以导致肿瘤细胞死亡。保护线粒体均不足以营救过表达caspase-8导致的死亡。4.4KO细胞是基因水平上同时敲除caspase-3/7/8/9,其对TNF-α,ABT737以及顺铂诱导的细胞凋亡均具有强大的抵抗效果,但是在其中表达caspase-8仍旧可以导致细胞死亡。5.敲除凋亡途径的caspase的4KO细胞以及单独敲除caspase-8的KOC8细胞,其细胞增殖能力增强,但是迁移能力减弱。6.过表达caspase-8的细胞溶酶体功能受损,LysoSensor Green以及acridine orange染色均表示溶酶体内部PH升高,LGALS3的斑点聚集以及Cathepsin L的散在分布表示溶酶体去稳定化。7.Caspase-8通过与溶酶体ATPase复合体相互作用,抑制ATPase的活性,影响其维持溶酶体酸性环境的功能,导致溶酶体pH值持续升高进而引发细胞死亡。这一过程主要是通过P10小亚基与V-ATPase相互作用的。8.过表达P10会导致细胞的逐渐死亡,同时增强细胞对溶酶体压力的敏感性。结论我们研究显示外源表达caspase-8可以导致细胞死亡,其死亡可以不依赖酶活性功能且与经典凋亡途径无关;Caspase-8能够与溶酶体V-ATPase的亚基相互作用,导致溶酶体pH升高。持续的溶酶体碱化会促进溶酶体选择性或者部分性的去稳定化,导致溶酶破坏从而诱导细胞死亡。Caspase-8衍生的截断体P10可以行使与溶酶体质子泵亚基相互作用的功能,过表达P10不但会导致细胞死亡,也可以增强对亲溶酶体药物的敏感性。本课题的研究有助于进一步理解caspase-8在肿瘤细胞中的作用,并可为肿瘤尤其是凋亡抵抗的肿瘤治疗提供新的潜在治疗靶点。