骨肉瘤是儿童和青少年时期最常见的早期恶性骨肿瘤类型，它具有发展快、转移早、预后差的特点，其五年生存率仅为20%。在最近十几年随着新辅助化疗联合手术治疗的应用，5年生存率增长到60-70%，但是传统的化疗药物由于特异性较低，副反应多，严重制约着其在肿瘤临床治疗中的应用。因此，探索新型的治疗骨肉瘤的药物及它们的具体分子机制仍然是一个亟待解决的问题。本研究从400种小分子化合物（其中305种为天然小分子化合物）中筛选出17种具有抗骨肉瘤活性的化合物，并对其中异土木香内酯和维生素K4两种化合物的抗骨肉瘤分子机制做了进一步研究，主要结果如下：1、异土木香内酯是一种萜类化合物，其抗骨肉瘤作用和机制未见报道。我们采用MTT法测定异土木香内酯对U2OS、MG-63和Saos-2细胞增殖的抑制作用，使用流式细胞术测定细胞凋亡、细胞周期、细胞内活性氧（ROS）水平、细胞线粒体膜电位（MMP）变化，利用Western blot和CO-IP检测测定凋亡相关蛋白的表达及相互作用，另外应用real-time PCR技术检测了周期相关蛋白cyclin B1的mRNA水平的表达。在这项研究中我们首次发现异土木香内酯对骨肉瘤细胞系U2OS、MG-63和Saos-2的细胞增殖有明显的抑制作用，IC50分别是～40μM、～50μM、～30μM。异土木香内酯引起骨肉瘤细胞S期和G2/M期阻滞，伴随着周期调控关键蛋白cyclin B1在mRNA水平和蛋白水平的下调。异土木香内酯处理后，骨肉瘤细胞内的ROS水平升高，线粒体膜电位下降，细胞凋亡，同时伴随着凋亡蛋白Bcl-2表达上调、Bax表达下调，caspase-3以及PARP裂解片段增多等。另外我们还首次发现异土木香内酯通过死亡受体途径：DR5/FADD/caspase-8信号通路诱导细胞凋亡。2、维生素K4（VK4）是一种水溶性的甲萘醌化合物，为VK2的人工合成衍生物，最初被用作临床止血药物。近年有研究表明VK与血管健康、骨代谢有着密切关系。本课题初步研究了VK4对骨肉瘤细胞系U2OS的生长抑制作用及其相关机制。我们采用MTT法测定VK4对U2OS细胞增殖的抑制作用，使用流式细胞术测定细胞凋亡、细胞周期、细胞内活性氧（ROS）水平、细胞线粒体膜电位（MMP）变化，Hoechst33242染色观察细胞内核固缩与染色质片段化，利用Western blot测定凋亡相关蛋白的表达。MTT结果显示，VK4显著抑制U2OS细胞增殖，作用呈剂量依赖性，IC50～25μM。Hoechst33242染色结果显示VK4引起了U2OS细胞核DNA断裂产生凋亡小体。Annexin V-FITC/PI双染也证实VK4诱导U2OS细胞凋亡。PI染色确定了VK4使U2OS细胞周期阻滞在S期。进一步的机制研究发现VK4对可诱导U2OS细胞线粒体膜电位下降，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达下调，Bax的表达上调，并且促进了caspase-3的激活。另外我们还发现VK4对骨肉瘤细胞的迁移有显著的抑制作用，其具体机制有待进一步研究。本课题研究获得的一系列对骨肉瘤细胞系具有选择性抑制作用的活性化合物一方面可以作为小分子探针进一步研究骨肉瘤的发病机理，另一方面可能成为骨肉瘤治疗的先导化合物。