目的：通过研究健脾活骨方药(JPF)不同部位对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖、迁移以及成骨成脂分化的影响,筛选出有效部位,并通过Wnt通路和BMP通路探索相关作用机制,为指导JPF在临床治疗非创伤股骨头坏死中的合理运用和进一步新药研发提供实验依据。方法：1.选用4周龄健康雄性SD大鼠,采用全骨髓贴壁法提取分离大鼠原代BMSCs,按1：3比例传代,第3-5代细胞用于实验；2.JPF经过水煎煮,醇沉,减压浓缩,系统溶剂分离,得到以下不同的提取部位：石油醚部位,氯仿部位,乙酸乙酯部位,正丁醇部位和水部位。制备成含生药1g/ml的药液；3.将不同浓度(10-7～10-2mg/ml)石油醚部位,氯仿部位,乙酸乙酯部位,正丁醇部位和水部位JPF药物与BMSC共孵育48h后,采用MTS法检测药物对细胞的增殖情况：4.不同浓度(10-6～10-4mg/ml)石油醚部位,氯仿部位,乙酸乙酯部位,正丁醇部位和水部位JPF药物与BMSCs作用7d或14d,经成骨分化诱导培养基和成分化诱导培养基分别诱导BMSCs向成脂骨以及成脂分化,采用ALP染色以及ARS染色法检测药物对BMSCs成骨分化的影响；采用油红O染色检测药物对BMSCs成脂分化的影响；5.将水部位与BMSCs作用7d或14d,收集细胞上清采用ELISA检测、收集细胞RNA采用Real-time PCR检测水部位对成骨分化过程中标志性因子ALP, BMP2, Dlx5, OCN, Runx2的表达；乙酸乙酯部位对成脂分化过程中标志性因子PPARγ、LPL和AP2的表达；6.加入Wnt通路的抑制剂DKK-1,与BMP通路抑制剂Noggin,进而采用加入通路抑制剂DKK-1以及Noggin,通过western方法,检测通路下游因子的表达情况,进而明确药物的作用机制。结果：1.,JPF不同提取部位对体外培养的大鼠BMSCs增殖的影响JPF不同提取部位的有效浓度(10-6～10-2 mg/ml)对体外培养大鼠BMSCs均有不同程度的促进细胞增殖的作用。其中提取水部位的不同浓度能够显著的促进BMSCs的增殖作用(P<0.05,P<0.01或P<0.001),且有浓度依赖性。氯仿部位的不同浓度也能够明显促进BMSCs的增殖(P<0.05,P<0.01或P<0.001),且有浓度依赖性。正丁醇部位的不同浓度对BMSCs的增殖亦具有明显的促进作用(P<0.05,P<0.01或P<0.001),只在10-6～10-4 mg/ml内有浓度依赖性。乙酸乙酯部位的不同浓度对BMSCs的增殖具有明显的促进作用(P<0.05,P<0.01),量效关系不明显。2.JPF不同提取部位对体外培养的大鼠BMSCs成骨成脂分化的影响JPF不同提取部位的有效浓度(10-6～10-4 mg/ml)对体外培养大鼠BMSCs向成骨方向分化以及向成脂方向分化的作用不同。其中,水部位能够浓度依赖性的促进ALP活性的增强以及钙结节的形成(P<0.05,P<0.01或P<0.001),且以高浓度作用效果最佳。同时对成脂分化有一定的抑制作用(P<0.05, P<0.01),但剂量关系不明显。乙酸乙酯能够浓度依赖性的抑制脂肪细胞的形成(P<0.05,P<0.01)。氯仿部位能够较好的促进钙结节的形成(P<0.05,P<0.01或P<0.001),但对于ALP活性以及脂肪细胞生成的影响不明显。正丁醇对成骨成脂分化的作用均不显著。3.,JPF提取水部位对体外培养大鼠的BMSCs成骨分化标志性蛋白表达的影响水部位的不同浓度(25ng/ml,50ng/ml, 100ng/ml)能够明显促进BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶活性的表达,且有浓度依赖性,其中高剂量的作用效果与阳性药作用效果相仿。水部位还能够明显促进BMSCs上清中β-catenin以及BMP2的表达,通过对成骨分化因子mRNA表达的研究,结果发现,水部位中、高剂量(50ng/ml 100ng/ml)对成骨分化过程中不同时期的标志性蛋白均有显著的调节作用：如早期的(ALP. Dlx5)、中期(Runx2、BMP2)、晚期(OCN)的mRNA表达均有显著的促进作用(P<0.05,P<0.01),低剂量(25ng/ml)对ALP和BMP2的mRNA表达亦具有显著的促进作用(P<0.05),但对Dlx5,OCN以及Runx2的mRNA表达没有太大影响。4.,J-PF提取水部位促进体外培养的大鼠BMSCs动员迁移的影响水部位的不同浓度(25～100ng/ml)能够有效的促进BMSCs的动员迁移行为,低、中、高剂量能够显著促进BMSCs的迁移距离(P<0.05,P<0.001或P<0.001)和迁移面积(P<0.05,P<0.05或P<0.001)。5.JPF提取水部位促进体外培养的大鼠BMSCs成骨分化的作用机制为探讨JPF提取水部位对BMSCs成骨分化的作用通路以及主要靶点,我们采用加入Wnt通路的抑制剂DKK-1,与BMP通路抑制剂Noggin,结果发现,加入DKK-1和Noggin后,经ARS染色检测钙结节的形成,100ng/m1JPF提取水部位促进钙结节的形成明显受到抑制,表现为吸光度值和染色面积明显减少(P<0.05,P<0.01)。进一步我们通过western检测成骨分化的主要通路Wnt信号通路的下游蛋白的表达情况,结果发现,β-catenin, Runx2在加入抑制剂DKK-1后表达显著降低,同样,BMP信号通路的下游蛋白(β-catenin, Runx2, OSX)在加入抑制剂Noggin后的表达也出现了明显的降低。6.JPF提取乙酸乙酯部位对体外培养的大鼠BMSCs成脂分化的影响乙酸乙酯部位的不同浓度(1～100ng/ml)也能够显著抑制由成脂诱导分化培养基诱导的BMSCs成脂分化,能够显著减少脂肪细胞的数量以及阳性染色面积(P<0.05或P<0.01),并且呈现浓度依赖性。而且乙酸乙酯部位的低、中、高剂量能够明显抑制成脂分化过程中的关键转录因子PPARγ,起始转录因子LPL以及分化终端因子AP2的蛋白表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001)和rnRNA表达(P<0.05或P<0.01)。7.JPF提取乙酸乙酯部位对体外培养的大鼠BMSCs成脂分化的作用机制为探讨JPF提取乙酸乙酯部位对BMSCs成脂分化的作用通路以及主要靶点,我们采用加入Wnt通路的抑制剂DKK-1,与BMP通路抑制剂Noggin.加入Wnt通路抑制剂后,乙酸乙酯高剂量油红O染色结果表明,脂肪细胞数量和面积没有减少,反而出现显著增多的现象(P<0.05或P<0.01)。Wnnt通路被阻断后,其抑制成脂分化的作用也被阻断,提示药物可能是通过Wnt通路发挥作用；相应的WB实验结果中,药物高剂量组加抑制剂组的蛋白表达明显增多(P<0.01或P<0.001),进一步验证了药物是通过Wnt通路发挥其抑制成脂分化的作用。加入BMP通路抑制剂后,乙酸乙酯高剂量油红O染色结果表明,脂肪细胞数量和面积出现显著减少的现象(P<0.05或P<0.01)。BMP通路被阻断后,其促进成脂分化的作用也被阻断,出现成脂分化被显著抑制的现象,提示药物可能是通过BMP通路发挥作用；相应的WB实验结果中,药物高剂量组加抑制剂组的蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01),进一步验证了药物是通过BMP通路发挥其抑制成脂分化的作用。综上,本研究通过JPF的不同提取部位对体外培养大鼠BMSCs的增殖、分化以及迁移作用的研究,筛选出了JPF发挥促成骨作用的有效部位是水部位,抑制成脂分化的有效部位是乙酸乙酯部位,进一步的机制探讨中,初步明确了药物发挥促进成骨分化以及抑制成脂分化是通过Wnt信号通路BMP信号通路发挥药效作用的。