目的使用血清蛋白质组学分析技术(serological proteome analysis,SERPA)筛选、检索基因组学与食管鳞癌诊断相关文献、系统综述抗肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAAs)自身抗体与食管癌诊断相关研究,回顾总结本课题组前期研究结果,鉴定可能的特异性候选食管鳞状细胞癌(食管鳞癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)相关抗原,设计并优化出可以用于ESCC诊断的抗-TAAs自身抗体组合,构建相应的ESCC患病预测模型,对所优化组合用于ESCC早期诊断的可能性和可行性进行全面的评价,并使用一组独立的人群样本资料对所构建的患病预测模型的诊断价值进行验证,为建立一种新的食管鳞癌早期体外非侵入性诊断技术提供依据和资料。方法1.蛋白质组学技术筛选和鉴定可能的候选ESCC相关抗原。1)Western blot方法初步筛选候选ESCC相关抗原及对应抗体阳性的患者血清:使用102例ESCC患者血清和58例正常对照血清与食管鳞癌细胞系TE-2、TE-8、EC1和EC9706全蛋白进行Western blot杂交,筛选ESCC患者血清中对应自身抗体阳性率≥10%,并且对应自身抗体在ESCC患者血清中阳性率大于正常对照血清中阳性率(p<0.05)的反应条带所对应的蛋白作为可能的候选ESCC相关抗原,同时挑选出针对候选ESCC相关抗原特异性阳性反应的ESCC患者血清。2)使用免疫荧光方法进一步验证Western blot筛选出来的针对候选ESCC相关抗原呈阳性反应的患者血清,并观察候选肿瘤相关抗原的细胞学定位。3)使用SERPA技术筛选和鉴定候选食管鳞癌相关抗原:裂解TE-8细胞株全蛋白,在相同条件下同时进行三根IPG预制胶条的等电聚焦电泳,SDS-PAGE凝胶电泳后,其中一块凝胶使用考马斯亮蓝R250染色,另外两块凝胶电转到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)后分别与上述挑选出的阳性ESCC患者血清和正常对照血清进行Western blot杂交,杂交后的结果与考马斯亮蓝R250染色凝胶进行比对,将血清学反应阳性的蛋白点进行质谱分析和鉴定,确定所筛选出候选ESCC相关抗原的种类和详细信息。2.候选TAAs的原核表达和纯化:在基于SERPA方法筛选候选TAAs的基础上,检索基因组学与食管鳞癌相关文献,系统综述抗-TAAs自身抗体与食管癌诊断相关文献报道,结合本课题组前期相关研究结果,对可能的食管鳞癌候选TAAs进行原核表达和纯化。1)候选TAAs原核表达载体的构建:提取EC9706细胞株总RNA,逆转录为cDNA,使用特异性PCR引物扩增出目的基因,连接入克隆载体后进行酶切鉴定和测序分析,鉴定正确的目的基因连接入原核表达载体pET-28a中。2)候选TAAs的原核表达和纯化:将重组表达质粒转化入宿主表达菌中,优化IPTG诱导蛋白表达浓度,对表达蛋白进行可溶性分析。可溶性表达蛋白使用不同浓度的咪唑进行纯化,不可溶性表达蛋白使用不同pH值的8M尿素进行纯化,并对纯化后的蛋白进行浓度测定。3)纯化蛋白的免疫学活性鉴定:使用特异性抗体与所纯化蛋白进行Western blot杂交,鉴定所纯化蛋白是否具有免疫学活性。3.候选TAAs自身抗体在ESCC诊断中的价值评价以及ESCC患病预测模型的建立与验证。1)单个抗-TAA自身抗体指标对食管鳞癌的诊断价值评价:采取间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测每种抗-TAA自身抗体在不同研究对象血清中的相对表达量,使用秩和检验或独立样本t检验比较每种抗-TAA自身抗体在ESCC患者组和正常对照组血清中的表达量差异;以受试组(包括324例ESCC患者和324例正常对照)中每个研究对象血清中每种抗-TAA自身抗体的表达含量为自变量,ESCC患病事件作为因变量,采取logistic回归的方法得出每种抗-TAA自身抗体的表达与ESCC患病事件的回归方程并计算出各个研究对象患食管鳞癌的预测概率,以预测概率=0.5作为截断值,判定每种自身抗体用于诊断ESCC的灵敏度和特异度,受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析评价每种自身抗体对ESCC的诊断价值。将ESCC患者分为早期ESCC组(TNM分期为0,I和II期)和晚期ESCC组(TNM分期为III和IV期),统计并比较各自身抗体指标对不同分期ESCC患者诊断的阳性率,以判定是否具有特异性的早期ESCC相关抗原指标。2)建立ESCC患病预测模型:以受试组人群为研究对象,根据每个研究对象血清中检测自身抗体的含量与ESCC患病事件,采用后退(条件)逐步logistic回归法筛选自变量并构建相应的预测模型,计算出各个研究对象患食管鳞癌的预测概率,以预测概率=0.5作为截断值,判定患病预测模型用于诊断ESCC的灵敏度和特异度,并使用ROC曲线分析评价该模型对受试组中ESCC患者的诊断价值。逐一剔除纳入自变量后对预测模型诊断价值(包括灵敏度、特异度、AUC以及判定结果符合率等)贡献最小的抗-TAA自身抗体指标,构建新的预测模型,并判定所构建预测模型对ESCC的诊断价值,以优化抗-TAAs自身抗体组合。3)预测模型的验证:以验证组人群(包括186例ESCC患者和186例正常对照)为研究对象,将各个研究对象对应TAAs自身抗体含量代入上述构建预测模型中,根据预测概率确定食管鳞癌患病事件,使用ROC曲线分析评价构建模型在验证组中对ESCC的诊断价值。4)所构建预测模型对不同分期ESCC患者的诊断:分别评价并比较上述构建预测模型对受试组和验证组早期ESCC患者和晚期ESCC患者的诊断价值,以分析预测模型是否具有早期ESCC诊断特异性。使用预测模型对研究对象中所有早期ESCC患者与正常对照进行判定,以预测模型从正常人群中区分出早期ESCC患者的能力,从而进一步评价预测模型对于早期ESCC的诊断价值。结果1.使用蛋白质组学技术筛选和鉴定出四种候选的食管鳞癌相关抗原Western blot方法筛选发现分子量在40kD、50kD以及65kD附近的三条蛋白条带的自身抗体在ESCC患者血清中阳性率明显高于正常对照血清;质谱鉴定结果显示SERPA方法筛选出的候选TAAs分别为hnRNP1A2B1 isform A2(异质核核糖核蛋白A2/B1的A2亚型,36kD)、CALR(钙网蛋白,48kD)、ENO1(烯醇酶-1,47kD)和HSPD1(热休克蛋白60,61kD)。2.成功构建了hnRNPA2B1、CALR、HSPD1和NICD(NOTCH1胞内段)四种重组蛋白的原核表达载体,并成功表达和纯化出这四种候选TAAs重组蛋白,且所纯化出的蛋白均具有免疫学活性。3.对研究对象中15种TAAs(hnRNPA2B1、CALR、ENO1、HSPD1、p53、NICD、c-myc、p62/IMP2、MDM2、p90/CIP2A、p16/INK4A、HCCR/LETMD1、IMP1、Koc/IMP3和Cyclin E)自身抗体水平进行分析,成功建立起一种基于10种TAAs(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1、Koc和IMP1)的食管鳞癌患病logistic回归预测模型,该预测模型应用于受试组研究对象ESCC诊断的灵敏度为71.6%,特异度为85.2%,AUC为0.871(95%CI:0.843-0.896),判定结果符合率为78.4%。对抗-TAAs自身抗体组合进行进一步优化,基于9种抗-TAAs抗体组合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1和Koc)的预测模型用于ESCC诊断所对应的AUC最大(AUC=0.872,95%CI:0.844-0.897),而基于7种自身抗体(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的预测模型对研究对象是否患病的判定结果符合率最高(判定结果符合率为79.2%)。该7种自身抗体预测模型对于受试组食管鳞癌诊断的AUC为0.864,灵敏度为71.9%,特异度为86.4%,对于验证组食管鳞癌诊断的AUC为0.862,灵敏度为65.6%,特异度为90.3%。与其它组合相比,该7种自身抗体组合具有较高的诊断效能和更高的性价比,并且该模型能够较好的从正常人群中区分出早期ESCC患者,对早期ESCC患者诊断的AUC为0.864,灵敏度为71.9%,特异度为87.8%,总判定结果符合率为83.7%。结论1.hnRNP1A2B1、CALR、ENO1和HSPD1可能是候选的食管鳞癌相关抗原。2.基于7种抗-TAAs自身抗体组合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的预测模型能够对食管鳞癌,尤其是早期食管鳞癌提供一定的诊断价值。