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目的探讨腺病毒介导的sh RNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)表达对体外培养的活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)粘附与迁移的影响及其可能的信号转导机制。方法利用AD293细胞反复的被腺病毒感染的方法扩增实验所需的腺病毒(AdGFP、Ad-sh RNA/PTEN),并且测定两组病毒滴度;体外培养活化大鼠HSC系(HSC-T6),以腺病毒为载体将靶向PTEN的sh RNA干扰重组体瞬时转染至活化HSC;采用Western blot方法检测HSC的PTEN、细胞外信号调节激酶1(extracellular signal-regulated kinase1,ERK1)、磷酸化ERK1(phosphorylated ERK1,p-ERK1)蛋白表达;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法与甲苯胺蓝染色法测定HSC的粘附能力;采用划痕修复实验测定HSC的平面迁移能力、Transwell小室测定HSC的跨膜迁移能力。所有资料应用Excel 2010建立数据库,应用SPSS19.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较应用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。实验分组如下:(1)Control组:在转染病毒步骤加入无血清无抗生素的DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP组:在转染步骤加入只表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空病毒;(3)Ad-sh RNA/PTEN组:转染靶向PTEN的sh RNA干扰序列并同时表达GFP的重组腺病毒。结果1通过反复感染AD293细胞的方法获得实验所需腺病毒液Ad-GFP、Adsh RNA/PTEN,其滴度分别为:1.3×109pfu/m L、1.5×109pfu/m L。2感染倍数(Multiplicity of infection,M.O.I.)20时,腺病毒感染HSC后48h,计数GFP荧光阳性的表达细胞,测的Ad-GFP、Ad-sh RNA/PTEN组腺病毒转染率均>80%。3腺病毒转染后48h,实时荧光定量PCR检测各组HSC的PTEN m RNA表达,并采用2-△△Ct相对定量法比较,其中以Control组PTEN基因表达量为1,Ad-GFP组、Ad-sh RNA/PTEN组较Control组的PTEN m RNA的相对表达量分别为0.92倍和0.64倍,Ad-sh RNA/PTEN组PTEN m RNA表达明显低于Control组及Ad-GFP组(P<0.05);Control组与Ad-GFP组PTEN m RNA表达无明显差异(P>0.05)。应用Western blot技术检测各组HSC的PTEN蛋白表达显示:Adsh RNA/PTEN组(1.088±0.036)显著低于Control组(1.438±0.038)及Ad-GFP(1.413±0.058),P<0.05;Control组与Ad-GFP组之间无明显性差异(P>0.05)。4甲苯胺蓝染色法检测HSC粘附能力:腺病毒感染HSC 48 h,与Control组粘附的细胞数(495.00±13.23)、Ad-GFP组粘附细胞数(500.00±18.03)相比,Ad-sh RNA/PTEN组粘附细胞数(592.00±12.53)明显增多(P<0.05);而Ad-GFP组与Control组之间粘附细胞数无明显差异(P>0.05)。5 MTT比色法测定HSC粘附能力:腺病毒感染HSC 48 h,与Control组的吸光度(Absorbance,A)值(0.279±0.015)相比,Ad-GFP组A值(0.285±0.011),两组间A值无明显差异(P>0.05),Ad-GFP组HSC粘附率为102.67±8.29%;Ad-sh RNA/PTEN组A值(0.335±0.013),较Control组及Ad-GFP组明显增高(P<0.05),Adsh RNA/PTEN组HSC粘附率为120.34±7.26%。6划痕修复实验显示:划痕后12h各组HSC均向中间有所迁移,但迁移距离经计算无统计学意义(P>0.05);划痕后24 h HSC向中间迁移的距离,Control组(207.78±3.24μm)、Adsh RNA/PTEN组(225.00±4.48μm)、Ad-GFP组(207.95±3.54μm),Adsh RNA/PTEN组与Ad-GFP组及Control组相比有显著差异(P<0.05),Ad-GFP组与Control组相比无显著差异(P>0.05);划痕后48 h HSC向中间迁移的距离,Control组(284.33±2.52μm)、Ad-sh RNA/PTEN组(312.87±2.25μm)、Ad-GFP组(281.98±4.34μm),Ad-sh RNA/PTEN组与Control组及Ad-GFP组相比有显著性差异(P<0.05),Control组及Ad-GFP组无差异(P>0.05)。7Transwell小室检测HSC跨膜迁移结果示:Ad-sh RNA/PTEN组跨膜细胞数(101.67±3.06)较Ad-GFP组跨膜细胞数(67.67±1.53)及Control组跨膜细胞数(69.33±2.52)显著增多(P<0.05),Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。8应用Western blot和实时荧光定量PCR方法检测腺病毒感染HSC48 h后各组HSC ERK1蛋白及其m RNA表达,其结果表明各组ERK1蛋白及其m RNA表达均无明显变化(P>0.05);应用Western blot检测各组p-ERK1蛋白表达,Ad-sh RNA/PTEN组(1.067±0.047)、Control组(0.710±0.023)及AdGFP组(0.692±0.037),Ad-sh RNA/PTEN组较Control组及Ad-GFP组表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而Control组及Ad-GFP组之间无显著差异(P>0.05)。结论1 PTEN低表达可促进体外活化HSC的粘附;2 PTEN低表达可促进体外活化HSC的平面迁移及跨膜迁移;3 ERK信号通路参与了PTEN对活化HSC粘附、迁移的调控。